《Brain and Behavior》：Proteomic Analysis of Corpora Amylacea Extracted From Post-mortem Brain of MAiD-end-of-life Sporadic ALS Patients
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目的：淀粉样小体（Corpora amylacea, CA）是中枢神经系统（central nervous system, CNS）随衰老累积的淀粉样包涵体，在包括肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）在内的神
目的：淀粉样小体（Corpora amylacea, CA）是中枢神经系统（central nervous system, CNS）随衰老累积的淀粉样包涵体，在包括肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）在内的神经退行性疾病中富集。尽管常被视作废物储存库，其细胞起源、分子组成及病理意义仍不明确。方法：研究人员对从散发性ALS患者及对照者的尸检脑组织中分离的纯化CA进行了无偏倚蛋白质组学分析。结果：深度质谱分析共鉴定到4470种蛋白质，其中658种完成定量，揭示了独特的ALS特异性蛋白质组特征。富集蛋白包括细胞骨架重塑、线粒体功能障碍及蛋白质稳态（proteostasis）破坏相关标志物，以及TDP-43、神经丝蛋白等已知ALS相关蛋白。这些发现表明CA可作为功能失调的疾病相关蛋白储存库，并捕获了ALS的关键病理过程。结论：通过对纯化CA应用无偏倚蛋白质组学方法，本研究首次提供了ALS中CA蛋白质含量的全面图谱，支持其作为生物标志物来源及神经退行性疾病机制研究的潜在价值。意义：目前尚未有针对ALS背景下CA的无偏倚分析。本研究首次通过生化方法从ALS患者脑组织中分离纯化CA并完成蛋白质组学分析，证实CA含有散发性ALS相关的疾病相关蛋白。通过证明CA作为代谢、细胞骨架组织及蛋白质稳态相关功能失调蛋白的储存库，本研究强调了其作为ALS特异性病理机制新见解来源的潜力。
《Brain and Behavior》发表的这项研究聚焦于神经退行性疾病肌萎缩侧索硬化症（ALS）中一类长期被忽视的结构——淀粉样小体（Corpora amylacea, CA）。ALS是一种累及脑和脊髓运动神经元的致命性神经退行性疾病，患者预后极差，确诊后生存期仅3至5年。目前该病的核心病理特征是病理性磷酸化TDP-43蛋白的累积，导致关键细胞功能紊乱并驱动神经元死亡。尽管科研投入巨大，目前仍缺乏有效治愈手段，疾病修饰疗法极为有限。一个主要的临床和研究瓶颈在于缺乏可靠的生物标志物，这阻碍了患者分层、早期诊断、疾病进展监测及临床试验疗效评估。传统生物标志物主要来源于脑脊液和血液，但难以完全反映脑内复杂的病理变化。尸检脑组织虽是研究ALS病理生理的宝贵资源，但其内部结构蕴含的信息仍有待挖掘。CA自1839年被发现以来，一直被视为中枢神经系统衰老的标志物，在阿尔茨海默病、ALS等神经退行性疾病中丰度显著增加。传统观点认为CA是细胞清除的废物容器，但其确切的分子组成、在ALS中的具体作用及相关性几乎未被探索。鉴于CA可能封存了脑内的病理蛋白，研究人员提出假设：CA可能不仅是代谢副产物的垃圾场，更是记录疾病分子特征的“时间胶囊”。因此，本研究旨在首次对ALS患者脑内的CA进行系统的蛋白质组学解析，以揭示其分子指纹并评估其作为新型生物标志物的潜力。
研究人员采用了严谨的实验设计。研究获得了加拿大国家伦理审查委员会的批准，所有参与者均签署了知情同意书。样本队列来源于加拿大的医疗辅助死亡（Medical Assistance in Dying, MAiD）项目，包含6例散发性ALS（sporadic ALS, sALS）患者和2例非ALS对照者（分别患有Charlevoix-Saguenay常染色体隐性痉挛性共济失调ARSACS和中枢神经系统原发性血管炎PACNS）。尸检取材自右侧大脑半球的前额叶皮层，死后间隔小于24小时。关键技术方法包括：利用改良的蔗糖梯度离心结合核酸酶和去氧胆酸钠处理，从脑组织中生化分离并纯化CA；采用苏木精-伊红染色和免疫荧光技术，使用p62和糖原合酶抗体对CA进行组织学定位和验证；应用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术对CA蛋白进行深度测序和鉴定；运用生物信息学工具进行基因本体论（Gene Ontology, GO）富集分析、主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）、层次聚类及差异表达分析；并利用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）软件构建ALS相关蛋白互作网络。
研究结果部分首先展示了CA的分离与表征。组织学和免疫荧光分析证实了CA在ALS和对照组脑组织中的存在，Western blot验证了提取物的纯度。随后，蛋白质组学景观分析显示，在总共鉴定的4470种蛋白质中，33.71%仅在ALS组的CA中被检测到，而对照组独有蛋白仅占3.51%，两组共有蛋白占62.78%。PCA清晰地分离了ALS和对照组样本，表明CA携带独特的ALS特异性蛋白质组特征。功能富集分析进一步揭示，ALS患者的CA蛋白主要富集于肽类分解代谢、脂质代谢及自噬等生物学过程。关于CA的细胞起源与功能谱，研究人员发现CA蛋白来源于细胞质、细胞膜、细胞骨架及线粒体等多种区室，体现了其整合异质性细胞材料的特性。GO分析还显示ALS CA中富含运输、蛋白质转运、宿主-病毒相互作用及神经发生等过程。在ALS相关蛋白鉴定方面，IPA分析识别出142种与ALS相关的蛋白，其中28种仅在ALS患者的CA中检测到，包括ALD5H1、ERGIC1等；而TDP-43、C9orf72、FUS等经典ALS致病蛋白则在两组中均有检出，但在ALS组内呈现异质性分布，反映了疾病的分子多样性。定量蛋白质组学分析基于标准化谱图丰度因子（Normalized Spectral Abundance Factor, NSAF）对658种高置信度蛋白进行了相对定量。层次聚类和PCA再次确认了ALS与对照组的显著分离。差异表达分析鉴定出166种显著改变的蛋白（p < 0.05，倍数变化 > 1.5）。在ALS CA中，蛋白酶体亚基（如PSMC2、PSMD1）、代谢酶（如ACACA、ACSL3）及细胞骨架动力学相关蛋白上调；而突触支架蛋白（如SHANK2、SHANK3）、细胞外基质成分及信号蛋白则显著下调。通路分析将这些变化与蛋白质折叠应激、代谢过程及蛋白质质量控制紧密关联。此外，最丰富的CA蛋白主要为细胞骨架成分，特别是微管蛋白家族（如TUBA1B、TUBB3）和神经丝蛋白（NEFL、NEFM）。
在讨论部分，研究人员指出本研究首次全面描绘了ALS患者CA的蛋白质组图谱。CA并非惰性的代谢废物，而是功能失调蛋白的重要储存库。CA蛋白的多源性（细胞质、膜、骨架、线粒体）支持了其在神经元和胶质细胞应激状态下积累广泛损伤物质的观点。定量分析揭示的ALS特异性特征，包括蛋白酶体通路的激活（提示蛋白质质量控制压力）、脂质代谢改变、突触蛋白减少以及细胞骨架成分的富集（如TUBA4A、神经丝蛋白），精准地映射了ALS的核心病理过程。值得注意的是，CA中检测到的TDP-43、FUS、C9orf72等蛋白的异质性分布，也侧面印证了散发性ALS的分子异质性。研究人员特别强调了使用MAiD来源组织的优势，相较于传统终末期尸检组织，MAiD样本能在神经元大量丢失前捕获疾病中间阶段的病理特征，为机制研究提供了独特窗口。同时，研究人员也客观指出了本研究的局限性：样本量较小、对照组非健康个体且年龄不匹配（对照组较年轻），这些因素可能对结果产生一定影响，未来研究需要纳入年龄匹配的健康对照进行验证。此外，优化磷酸化或错误折叠蛋白的检测技术也是未来的重要方向。
结论部分重申，本研究绘制了首张ALS淀粉样小体的综合蛋白质组图谱，证实其富含涉及关键致病通路的疾病相关蛋白。研究揭示了ALS患者来源CA的独特蛋白质组特征，确立了其作为生物标志物发现的潜在宝库地位，并为深入理解ALS病理生理学提供了新的视角。
