《Immunity, Inflammation and Disease》：Impaired IL-35/Treg Axis Facilitates Neuropathic Pain Via TNF-α, TLR4, and HMGB1 Activation
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背景：神经病理性疼痛（NP）是一种由于周围或中枢神经系统功能障碍导致的以持续性疼痛为特征的慢性病症。近期研究表明，免疫失调，特别是涉及调节性 T 细胞（Tregs）和炎症介质的免疫失调，在 NP 中发挥重要作用。白细胞介素 -35（IL-35）是由 Tregs
背景：神经病理性疼痛（NP）是一种由于周围或中枢神经系统功能障碍导致的以持续性疼痛为特征的慢性病症。近期研究表明，免疫失调，特别是涉及调节性 T 细胞（Tregs）和炎症介质的免疫失调，在 NP 中发挥重要作用。白细胞介素 -35（IL-35）是由 Tregs 分泌的一种抗炎细胞因子，已显示出潜在的免疫抑制作用，但其在 NP 中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨在大鼠神经病理性疼痛模型中，IL-35 的表达及其对 Treg 介导的免疫调节和炎症反应的调控作用。方法：共选取 18 只雄性 Sprague–Dawley 大鼠，随机分为对照组、假手术组和神经病理性疼痛（NP）组。采用坐骨神经慢性压迫性损伤（CCI）建立 NP 模型。术后多个时间点通过测量机械缩腿阈值（MWT）和热缩腿潜伏期（TWL）评估疼痛行为。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清中 IL-35 水平。利用流式细胞术评估 CD4?和 CD8?T 细胞亚群。采用苏木精 - 伊红（HE）染色对脊髓组织进行病理学分析。通过免疫组化、蛋白质印迹法（Western blotting）和实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）评估脊髓组织中 IL-35、肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）、Toll 样受体 4（TLR4）和高迁移率族蛋白 B1（HMGB1）的表达。结果：NP 组大鼠的 MWT 和 TWL 显著降低，证实模型构建成功。与对照组相比，NP 组血清 IL-35 水平和 CD4?T 细胞计数显著降低，而 CD8?T 细胞计数显著增加（p < 0.05）。组织病理学显示 NP 组脊髓背角存在神经元变性。在脊髓组织中，IL-35 的蛋白和 mRNA 水平显著下调，而 TNF-α、TLR4 和 HMGB1 的蛋白和 mRNA 水平均显著上调（p < 0.05）。结论：IL-35 在神经病理性疼痛中表达减少，这与 Treg 介导的免疫抑制功能降低和神经炎症增加相关。数据表明，IL-35 通过调节 T 细胞反应以及抑制 TNF-α、TLR4 和 HMGB1 信号通路来缓解神经病理性疼痛。IL-35 可能是神经病理性疼痛治疗的潜在靶点。
神经病理性疼痛（Neuropathic Pain, NP）作为一种由周围或中枢神经系统直接损伤或功能障碍引起的致残性慢性疼痛，其临床特征包括自发性疼痛、痛觉过敏及痛觉超敏，常伴随焦虑、抑郁等心理共病，严重影响患者生活质量。尽管现有药物如抗癫痫药、抗抑郁药及非甾体抗炎药在一定程度上能缓解症状，但仍有超过半数患者无法获得满意疗效，且其确切的病理生理机制尚未完全阐明。越来越多的证据表明，NP 并非单纯的神经系统疾病，而是一种涉及神经元、胶质细胞、免疫细胞及多种细胞因子复杂相互作用的神经免疫疾病。其中，胶质细胞激活释放的促炎介质如肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）等引发的神经炎症反应，是导致神经元高兴奋性和中枢敏化的重要因素。在众多免疫调节要素中，调节性 T 细胞（Tregs）通过分泌白细胞介素 -10（IL-10）、转化生长因子 -β（TGF-β）及白细胞介素 -35（IL-35）等抗炎细胞因子，在维持免疫稳态和限制过度炎症中发挥关键作用。IL-35 作为一种主要由 Tregs 分泌的异二聚体细胞因子，虽在多种病理条件下显示出免疫调节潜力，但其在 NP 中的具体作用机制及与胶质细胞介导的神经炎症、T 细胞免疫调节的相互作用尚不明确。此外，高迁移率族蛋白 B1（HMGB1）作为损伤相关分子模式（DAMP），在神经损伤后释放并结合 Toll 样受体 4（TLR4），激活下游炎症信号通路，形成 HMGB1–TLR4–TNF-α轴，持续维持神经炎症和疼痛。鉴于此，研究人员开展了一项系统性研究，旨在阐明 NP 大鼠模型中 IL-35 的表达谱及其对 T 细胞介导的免疫反应和主要炎症通路的调控作用，以期为 NP 的治疗提供新的理论依据和潜在靶点。该研究成果发表于《Immunity, Inflammation and Disease》期刊。
为开展此项研究，研究人员选用了 18 只雄性 Sprague–Dawley 大鼠作为实验对象，将其随机分配为正常对照组、假手术组和神经病理性疼痛（NP）组。研究采用了坐骨神经慢性压迫性损伤（CCI）模型来模拟临床神经病理性疼痛。关键技术方法包括：利用电子测痛仪和辐射热痛觉仪分别检测大鼠的机械缩腿阈值（MWT）和热缩腿潜伏期（TWL）以评估疼痛行为；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清中 IL-35 水平；运用流式细胞术分析外周血中 CD4?和 CD8?T 淋巴细胞亚群的变化；通过苏木精 - 伊红（HE）染色观察脊髓组织的病理形态学改变；综合运用免疫组化、蛋白质印迹法（Western blotting）以及实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）技术，从蛋白和 mRNA 水平多维度检测脊髓组织中 IL-35、TNF-α、TLR4 及 HMGB1 的表达情况。
研究结果主要包含以下几个方面：
首先，在机械和热痛阈值方面，研究发现 NP 组大鼠在术后第 1、3、5、7 和 14 天的机械缩腿阈值（MWT）和热缩腿潜伏期（TWL）均显著低于对照组和假手术组，表明模型成功诱导了机械性痛觉过敏和热痛觉过敏，证实了神经病理性疼痛表型的存在。
其次，在血清 IL-35 水平检测中，结果显示 NP 组大鼠血清中的 IL-35 水平较对照组显著下降，提示神经病理性疼痛状态下系统性抗炎介质受到抑制。
第三，在外周血 T 细胞亚群分析中，流式细胞术结果表明，与对照组相比，NP 组大鼠外周血中 CD4?T 细胞比例显著降低，而 CD8?T 细胞比例显著升高，显示出免疫谱系向促炎方向偏移，即调节性 T 细胞减少而细胞毒性 T 细胞增加。
第四，脊髓组织病理学检查发现，对照组和假手术组神经元形态完整，而 NP 组脊髓背角出现明显的神经元皱缩、核固缩、细胞变性及组织结构疏松等病理改变，符合慢性神经病理性疼痛伴随的神经损伤和神经炎症特征。
第五，在免疫组化分析中，NP 组脊髓组织中 IL-35 阳性染色显著减少，而促炎介质 TNF-α、TLR4 和 HMGB1 的阳性表达显著增加，提示炎症信号通路的激活。
第六，蛋白质印迹法（Western blotting）结果进一步证实，NP 组脊髓组织中 IL-35 蛋白表达显著下调，而 TNF-α、TLR4 和 HMGB1 蛋白表达显著上调。值得注意的是，HMGB1 检测到两条带，可能反映了其不同的分子或氧化还原形式。
最后，RT-PCR 分析显示，mRNA 水平的变化趋势与蛋白水平一致，即 NP 组 IL-35 转录水平显著降低，而 TNF-α、TLR4 和 HMGB1 的转录水平显著升高，且这些变化特异性地发生于神经损伤后，而非手术操作本身所致。
讨论部分总结指出，神经病理性疼痛的治疗仍是全球性难题，现有疗法效果有限。本研究通过构建 CCI 大鼠模型，结合行为学、组织学及分子生物学技术，深入揭示了 IL-35 在 NP 中的关键作用。研究结果证实，NP 状态下存在明显的免疫失调，表现为 CD4?T 细胞（主要是 Tregs）减少和 CD8?T 细胞增加，导致免疫抑制功能减弱。同时，IL-35 表达的下降削弱了对炎症反应的抑制作用，导致 HMGB1 释放增加，进而激活 TLR4 及其下游的 TNF-α等促炎因子，形成恶性循环，加剧神经炎症和中枢敏化。这一发现不仅丰富了人们对 NP 神经免疫机制的理解，特别是阐明了 IL-35/Treg 轴与 HMGB1/TLR4/TNF-α通路之间的相互作用，还提示恢复 IL-35 水平或增强其功能可能成为治疗神经病理性疼痛的新策略。尽管本研究存在仅基于动物实验、缺乏功能性干预验证等局限性，但其综合性的研究方法为后续开发针对 IL-35 通路的靶向药物奠定了坚实基础。
研究结论表明，在慢性压迫性损伤诱导的神经病理性疼痛大鼠模型中，IL-35 表达显著下调，这与脊髓内促炎标志物 TNF-α、TLR4 和 HMGB1 的增加密切相关。同时，T 细胞亚群发生改变，表现为 CD4?T 细胞减少和 CD8?T 细胞增加，提示免疫谱系向促炎方向转变，从而促进了神经病理性疼痛的维持。这些发现表明，IL-35 在神经病理性疼痛发展过程中对全身及局部免疫反应具有重要的调控作用，可能成为潜在的治疗靶点。
