基于分级分离与蛋白质组学图谱从曼德勒眼镜蛇(Naja mandalayensis)毒液中发掘mHippoE-18细胞神经保护候选肽

《Chemistry & Biodiversity》：Discovery of Neuroprotective Venom-Derived Candidates From Naja Mandalayensis in mHippoE-18 Cells Via Fractionation and Proteomic Mapping

　　

摘要：已有研究报道曼德勒眼镜蛇(Naja mandalayensis)毒液低分子量肽组分(PF-Nm)在海马源mHippoE-18细胞中具有神经保护活性。本研究研究人员在H2O2诱导氧化应激条件下，考察了PF-Nm经反相高效液相色谱(Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography, RP-HPLC)分离所得亚组分(Subfractions, SFs)的生物活性及蛋白质组组成。PF-Nm经RP-HPLC分离得到7个亚组分(SF1–SF6及SFX)。mHippoE-18细胞经各SF(0.001 μg mL?1)预处理4 h后，暴露于H2O2(0.5 mmol L?1)20 h。三个亚组分(SF4、SF5及SFX)通过改善膜完整性、代谢活性、线粒体膜电位(Mitochondrial Membrane Potential, ΔΨm)或减少活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)水平，显著拮抗H2O2诱导的细胞毒性。质谱分析基于与已知Naja属毒液蛋白(包括细胞毒素Cytotoxins, CTXs、三指毒素Three-Finger Toxins, 3FTxs及神经毒素相关序列)的相似性，分别在SF4、SF5和SFX中鉴定到19、27和4条肽序列匹配。结果表明PF-Nm中亚组分含有可对抗神经元细胞氧化损伤的活性成分，支持其作为发现神经保护性分子的重要来源。

论文解读：《Chemistry of Natural Compounds / Combinatorial Chemistry & Drug Discovery—Chem. Biodiversity相关毒液衍生神经保护肽研究》

本文报道了研究人员针对曼德勒眼镜蛇(Naja mandalayensis)毒液低分子量肽组分(Peptide Fraction from Naja mandalayensis venom, PF-Nm)，通过反相高效液相色谱(Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography, RP-HPLC)分级分离获得亚组分(Subfractions, SFs)，并在H₂O₂诱导氧化应激模型中使用小鼠海马神经元样mHippoE-18细胞评价其神经保护活性，结合液相色谱-电喷雾电离-离子阱-飞行时间串联质谱(LC-ESI-IT-TOF-MS/MS)进行蛋白质组学表征，以活性导向方式锁定具神经保护潜力的毒液肽类家族。研究发现SF4、SF5及SFX可分别通过改善细胞膜完整性、增强代谢活力、维持线粒体膜电位(ΔΨm)及降低ROS水平拮抗氧化损伤，其活性与细胞毒素(Cytotoxins, CTXs)、三指毒素(Three-Finger Toxins, 3FTxs)及弱神经毒素等Naja属特征性肽类密切相关，表明眼镜蛇毒液中小分子肽组分是神经保护分子骨架发掘的可行平台。该论文发表于《Chemistry and Biodiversity》(Chem. Biodiversity)。

主要关键技术方法：

研究人员使用缅甸圈养成年曼德勒眼镜蛇(Naja mandalayensis)混合毒液，按已发表方法制备低分子量肽组分(PF-Nm)；PF-Nm经Supelco C18分析柱以0–50%乙腈(含0.1%三氟乙酸Trifluoroacetic Acid, TFA)线性梯度洗脱进行RP-HPLC分离，收集7个紫外吸收峰对应SF1–SF6及SFX并冷冻干燥；各SF在0.001 μg mL^?1浓度下与小鼠海马永生化mHippoE-18细胞共孵育评估基础细胞毒性(结晶紫染色测膜完整性、刃天青Resazurin还原法测代谢活性)，再以各SF预孵4 h后加0.5 mmol L^?1H₂O₂处理20 h建立氧化应激模型，检测膜完整性、代谢活性、线粒体膜电位(ΔΨm，四甲基罗丹明甲酯Perchlorate of Tetramethylrhodamine Methyl Ester, TMRM探针)、乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase, LDH)释放及胞内ROS(2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯, 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate, H₂DCF-DA探针)；活性显著的SF4、SF5、SFX进行还原烷基化胰蛋白酶(Trypsin)酶解后，经LC-ESI-IT-TOF-MS/MS采集数据，使用PEAKS Studio比对UniProt中Naja属蛋白数据库进行肽段及蛋白注释。

2 Results and Discussion

2.1 Subfractionation of PF-Nm by RP-HPLC and Cytotoxic Profile of the Subfractions

PF-Nm经RP-HPLC在20–35 min洗脱得到7个明确峰(SF1、SFX、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6)。单独给予0.001 μg mL^?1各SF 24 h后，SF4使膜完整性相关存活率较对照升高9.2%(p = 0.0493)；SF5、SF6分别使代谢活性升高6.7%(p = 0.0327)和7.8%(p = 0.0428)；SFX使代谢活性降低8.1%(p = 0.0053)。丙烯酰胺(Acrylamide, 100 mmol L^?1)阳性对照组显著降低两项指标(p < 0.0001)。表明PF-Nm各亚组分具异质性生物学效应——部分具潜在细胞保护作用，部分呈轻微细胞毒性，据此进入氧化应激模型筛选。

2.2 SFs-Mediated Neuroprotection Against Oxidative Stress in mHippoE-18 Cells

H₂O₂处理后膜完整性下降14.4%、代谢活性下降6.2%(均p < 0.05)。预加SF4+H₂O₂及SFX+H₂O₂分别使膜完整性较H₂O₂组回升22.0%和22.1%(均p < 0.0001)；SF5+H₂O₂使代谢活性较H₂O₂组升高15.4%(p < 0.0001)，较对照升高8.2%(p = 0.0048)。H₂O₂使ΔΨm降低12.3%(p = 0.0370)，仅SFX+H₂O₂使ΔΨm较H₂O₂组升高11.9%(p = 0.0067)，提示SFX具维持线粒体功能作用。LDH释放显示SF5及SFX单独处理时轻度升高(p < 0.05)，表明具双相(轻微毒性/抗氧化保护)行为。ROS检测示SF4、SF5、SFX单独处理降低基线ROS；经膜完整性校正后，SF4+H₂O₂及SFX+H₂O₂使标准化ROS较H₂O₂组分别降低24.6%(p = 0.0002)和17.9%(p = 0.0116)。综上SF4、SF5、SFX具互补的神经保护谱，被选作质谱鉴定对象。

2.3 Mass Spectrometry Analysis of SF4, SF5, and SFX

SF4鉴定到19条肽序列匹配，主要属Naja属细胞毒素(CTXs)，次为三指毒素(3FTxs)及神经毒素，CTXs N端变异大、C端保守，符合3FTx家族β折叠核心二硫键稳定特征；推断CTX及膜相互作用毒素可能介导膜完整性保护与线粒体响应。SF5鉴定到27条肽序列匹配，复杂度最高，含短/长链α-神经毒素(可阻断烟碱型乙酰胆碱受体nicotinic Acetylcholine Receptors, nAChRs)、离子通道调节毒素、膜相关及具抗氧化暗示组分，多种毒素家族共存可解释其代谢激活与轻度细胞毒性并存的双相表现。SFX仅鉴定到4条匹配，均为弱或非典型三指神经毒素(Weak/Non-conventional 3FTxs)：NWT weak toxin(P0DSM9)、weak neurotoxin 6(P29180)、probable weak neurotoxin NNAM1(Q9YGI2)及长神经毒素同源物(O93422)，序列高度保守含保守基序LTCLICPEKYCNKVHTCLNGEK，微小氨基酸置换(如Arg→Lys、Gln→Glu、Ser→Thr、Asp→Ala)可能影响膜/受体互作及ROS调节，结构上稳定故可在氧化环境下保留功能，与SFX在氧化应激下的细胞保护现象相符。

讨论与结论总结（翻译结论部分）：

本研究表明曼德勒眼镜蛇(Naja mandalayensis)毒液低分子量肽组分(PF-Nm)中含有可在氧化应激下调控神经元反应的生物活性亚组分。在7个RP-HPLC衍生亚组分中，SF4、SF5和SFX对H₂O₂暴露的mHippoE-18细胞表现出各异但互补的保护效应，包括改善膜完整性、代谢活性、线粒体膜电位(ΔΨm)及降低ROS水平，说明各亚组分含可抵消氧化损伤的成分。蛋白质组学分析揭示三活性亚组分具异质组成：SF4主要含细胞毒素(CTXs)和三指毒素(3FTxs)；SF5分子多样性最高，含α-神经毒素、膜互作蛋白及不同功能类别组分；SFX呈简化谱，以结构高度保守且具细微氨基酸变异的弱/非典型神经毒素为主。SFX中结构保守3FTxs和弱神经毒素的鉴定及其细胞实验双相响应提示单个异构体或毒素组合可差异调节氧化应激相关信号通路。尽管蛋白质组数据提供了亚组分分子多样性信息，尚无法将观测效应直接归因至特定单一肽段。总之结果强调毒液肽多样性与神经保护表型的关联，未来需进一步分级、分离单一毒素并通过重组/合成肽及靶向氧化应激信号通路的机制实验验证因果。