RNA结合蛋白(RNA-binding proteins, RBPs)参与TAU依赖性神经退行性变的机制分析

《Neurobiology of Disease》：Analysis of the involvement of RNA-binding proteins in TAU-dependent neurodegeneration

　　

摘要：TAU依赖性神经退行性变涵盖一组统称为tau蛋白病(tauopathies)的疾病，其特征是微管相关蛋白TAU的病理性聚集。TAU是一种通过结合微管相关蛋白(microtubule-associated protein, MAP)来稳定神经元微管的蛋白，但新证据表明其还通过RNA结合蛋白(RNA-binding proteins, RBPs)与RNA代谢相互作用。RBPs对mRNA转运、翻译及应激颗粒(stress granules, SGs)形成的调控至关重要，而这对突触功能与维持尤为关键。研究人员假设TAU病理可诱导参与RNA转运、翻译起始前复合物(translation preinitiation complex, PIC)形成及SG组装的RBPs失调，从而促进神经退行性变。研究人员观察到，在腺相关病毒AAV-TAUP301L小鼠模型及8月龄转基因TAUP301S小鼠的海马，以及阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)患者样本中，参与RNA转运、PIC及SG形成的RBPs表达上调。该表达变化在mRNA及蛋白水平均可检测到，部分RBPs还伴随亚细胞定位改变。研究结果表明RBP失调是多种tau蛋白病的共同机制，可能与TAU功能受损相关；此外RBPs上调可能代表了对突触翻译缺陷的代偿性反应。

本文发表于《Neurobiology of Disease》，研究背景如下：Tau蛋白病(tauopathies)，包括额颞叶痴呆(frontotemporal dementia, FTD)和作为继发性tau蛋白病的阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)，以微管相关蛋白TAU(Microtubule-Associated Protein Tau, MAPT基因编码)的病理性过度磷酸化及聚集为特征。TAU经典功能是结合并稳定微管(microtubules, MTs)，但近年研究发现TAU可与RNA结合蛋白(RNA-binding proteins, RBPs)互作参与RNA代谢。RBPs调控mRNA的轴突/树突转运、局部翻译及应激颗粒(stress granules, SGs)组装，对突触可塑性和神经元存活至关重要。然而TAU病理如何导致突触功能衰竭——特别是TAU异常是否引起RBP介导的RNA代谢紊乱尚未明确。本研究旨在验证假说：病理性TAU过表达引起参与mRNA转运、翻译起始前复合物(translation preinitiation complex, PIC)形成及SG动力学的RBPs表达及亚细胞定位改变，进而损害突触局部翻译并促进神经退行。研究人员采用两种TAU突变小鼠模型(AAV-TAU^P301L海马局部注射模型和Tg-TAU^P301S/PS19转基因小鼠)、体外HT22海马神经元细胞微管扰动实验(colchicine微管去聚合/taxol微管稳定化)，并结合AD患者死后海马组织，通过RT-qPCR、Western blot、免疫荧光(immunofluorescence, IF)及免疫组化检测选定RBPs(Stau1/Stau2—RNA转运；Pabpc1/Pabpc4、Eif4e、Cpeb1、Atxn2—PIC组分；Tia1—SG标志)的mRNA和蛋白水平及亚细胞分布，证实TAU病理驱动RBPs转录上调及部分蛋白重新分布，提示RBP失调是TAU依赖性神经退行中RNA代谢重塑的共同特征，RBPs上调可能为代偿突触翻译不足，但持续异常可转为促病变因素。

主要关键技术方法：①动物模型——6月龄C57BL/6小鼠海马立体定位注射AAV9-synapsin1-hTAU^P301L(AAV-TAU^P301L模型，同侧为实验侧对侧为对照)及8月龄Tg-TAU^P301S(PS19)转基因小鼠(野生型对照)；②体外模型——小鼠海马神经元HT22细胞系经1 μM colchicine(微管去聚合剂)或1 μM taxol/paclitaxel(微管稳定剂)处理4/8/24 h；③人源样本——西班牙CIEN组织库提供的4例对照及4例AD患者死后冰冻海马组织及石蜡切片；④分子与成像检测——海马组织及细胞总RNA提取→RT-qPCR(内参基因为Actb、Gapdh、Tbp)，组织/细胞RIPA裂解液蛋白提取→Western blot(内参为Vinculin/GAPDH)，冰冻切片/细胞免疫荧光(IF)及石蜡切片免疫荧光共染色，激光共聚焦显微镜采集CA3区或神经元荧光强度并用ImageJ定量；⑤统计学——Kolmogorov–Smirnov正态检验后采用非配对Student's t检验或单因素ANOVA，GraphPad Prism分析。

研究结果如下：

3.1. TAU^P301Loverexpression increases mRNA and protein levels of RBPs in the hippocampus of the AAV-TAU^P301Lmouse model

研究人员对AAV-TAU^P301L小鼠海马同侧(过表达侧)与对侧对照进行RT-qPCR检测，发现参与PIC形成的Pabpc1、Pabpc4、Atxn2、Cpeb1、Eif4e，参与SG的Tia1，以及参与RNA转运的Stau1、Stau2的mRNA均显著上调(p<0.05~0.0001)。Western blot总蛋白裂解液中PABP和STAU1未见显著差异(离散度大)，但神经元水平免疫荧光显示CA3区过表达TAU^P301L的神经元内PABP荧光强度显著升高(p=0.0005)，TIA1蛋白(尤以核内为主)显著升高(p=0.0130)，STAU1蛋白水平无显著变化。结论：海马神经元过表达突变TAU^P301L引起多个功能类别RBPs转录上调及部分RBP在神经元内蛋白水平升高/重分布。

3.2. mRNA levels of RBPs are similarly increased in the hippocampus of 8-month-old Tg-TAU^P301Smice

为验证上述发现在独立tauopathy模型中的普适性，研究人员检测8月龄Tg-TAU^P301S(PS19)小鼠海马，RT-qPCR同样显示Pabpc1、Pabpc4、Atxn2、Cpeb1(呈升高趋势p=0.0946)、Eif4e、Tia1、Stau1、Stau2的mRNA显著上调(p<0.05~0.0001)，总组织裂解液Western blot中PABP和STAU1蛋白仍无显著差异。结论：不同突变TAU过表达模型均出现一致的RBP转录上调，提示RBP失调是TAU驱动病理的下游共同特征。

3.3. Microtubule dynamics differentially regulate RBP expression in HT22 neuronal cells

研究人员用colchicine(微管去聚合)和taxol(微管稳定化)处理HT22细胞，时间梯度qPCR显示colchicine使多数RBP mRNA(Pabpc4、Atxn2、Eif4e、Stau1、Stau2)下调，Pabpc1/Cpeb1/Tia1呈波动；taxol使Pabpc1/Pabpc4/Cpeb1/Tia1 mRNA下调，Atxn2/Eif4e/Stau1/Stau2在24 h轻微上调但不显著。但Western blot显示两药处理均在蛋白水平引起ATAXIN-2、eIF4E、STAU1及PABP显著上调。结论：单纯微管动力学扰动不足以复制体内TAU模型的RBP转录上调模式，微管破坏可影响RBP蛋白丰度但不是TAU特异性RBP失调的唯一原因，提示存在TAU特异的RNA代谢重编程机制(如异常RBP互作或持续应激信号)。

3.4. mRNA and protein levels of RBPs are increased in the hippocampus of AD patient

研究人员检测AD患者海马与对照，RT-qPCR显示PABPC1、PABPC4、ATXN2、CPEB1、EIF4E(均为PIC相关)、TIA1(SG相关)、STAU1和STAU2(RNA转运相关)的mRNA均显著上调(p<0.05~0.001)。免疫荧光显示含神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs；经AT100抗p-TAU^{Thr212,Ser214}鉴定)的神经元中PABP呈上升趋势(p=0.0935)，TIA1(核内为主)及STAUFEN1蛋白显著升高(p≤0.0184)。结论：继发性tauopathy(AD)海马亦重现小鼠模型中RBP转录及神经元蛋白水平上调模式，RBP失调是TAU病理(无论原发或继发)的共有下游表现。

讨论部分总结及结论翻译：本研究提供证据表明RBP失调是TAU依赖性神经退行的一致分子特征。两种TAU突变小鼠模型及AD患者海马均显示参与mRNA转运(STAU1/2)、翻译起始前复合物(PABPC1/4、EIF4E、CPEB1、ATXN2)及SG(TIA1)的RBPs协调转录上调；免疫荧光揭示神经元特异性蛋白变化，说明组织整体匀浆可能掩盖细胞特异性改变。微管扰动实验表明单纯细胞骨架破坏不能复现体内TAU模型的RBP转录谱，提示TAU病理通过特异性机制(异常RBP互作、RNA颗粒动力学改变或持续应激信号)驱动RNA代谢重塑。RBP尤其是STAUFEN和TIA1的上调可能初期为代偿突触局部翻译不足，但持续异常SG形成/TIA1高表达可致TAU-RBP复合体稳定化、相分离异常及翻译稳态崩溃，由适应转为致病。PIC组分协同上调也反映细胞试图补偿突触翻译缺陷。AD样本结果说明RBP失调是TAU病理(不限于MAPT突变)共同下游响应。综上，TAU病理引起涉及RNA转运、翻译起始和SG动态的RBPs失调，其程度与病理负荷相关；该RBP失调最初可为代偿性，但随疾病进展促成突触功能障碍和神经元丢失。调控RBP动态及翻译稳态可能是跨tau蛋白病谱的潜在治疗策略。

研究结论原文翻译：总之，本研究数据表明参与RNA转运、翻译起始及应激颗粒(stress granule, SG)动力学的RNA结合蛋白(RNA-binding proteins, RBPs)失调是TAU依赖性神经退行性变的一个稳健且随病程放大的特征。RBP改变的程度在不同tau蛋白病(tauopathy)模型中与TAU病理负荷相关，且在作为继发性tau蛋白病的阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)人类样本中亦观察到相似变化。这些发现支持如下模型：TAU病理驱动RNA代谢的进行性重塑，该过程起初可能为代偿性但最终促成突触功能障碍与神经元丢失。因此，靶向RBP动态及翻译稳态可能代表跨tau蛋白病谱系的一种有前景的治疗策略。