《Neurobiology of Sleep and Circadian Rhythms》：The progesterone to estradiol ratio predicts fear extinction in mice and humans.
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本研究旨在探究性类固醇激素，特别是雌二醇（estradiol, E2）和孕酮（progesterone, P4），对恐惧习得（fear acquisition, FA）和消退内恐惧消退（within-session fear extinction, FE）的单
本研究旨在探究性类固醇激素，特别是雌二醇（estradiol, E2）和孕酮（progesterone, P4），对恐惧习得（fear acquisition, FA）和消退内恐惧消退（within-session fear extinction, FE）的单独及联合影响。研究假设雌二醇促进FE训练，而孕酮无显著直接效应；同时假设口服避孕药（oral contraceptives agents, OCA）使用者与晚期卵泡期（late follicular, LF）女性在FA和FE模式上表现相似。研究在人类和小鼠中进行了跨物种验证。
人类被试包括男性、OCA使用者以及按早期卵泡期（early follicular, EF）、LF和黄体中期（mid-luteal, ML）分组的天然周期女性，共128人完成实验（95名女性，33名男性）。小鼠实验采用C57BL/6品系雄性和天然周期雌性，按动情周期阶段分为雄性、动情前期（proestrus）、动情期（estrus）、动情后期（metestrus）和动情间期（diestrus）五组。人类采用为期两天的实验方案：第一天进行FA训练，包括皮肤电反应（skin conductance response, SCR）、恐惧增强惊跳反应（fear-potentiated startle, FPS）和风险评级（risk ratings, RR）测量，同时采集唾液样本和阴道细胞学样本；第二天进行FE训练，测量指标相同但不再呈现非条件刺激（unconditioned stimulus, US）。小鼠同样采用两天方案：第一天进行线索化恐惧习得（cued fear acquisition），以足部电击为US、音调为条件刺激（conditioned stimulus, CS）；24小时后进行FE训练，以僵直行为（freezing）作为恐惧指标。人类唾液和小鼠血浆中的性激素水平均采用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）进行定量分析。人类机器学习分析采用基于直方图的梯度提升回归树（Histogram-based Gradient Boosting Regression Tree, HGBRT），以FE期间的CS辨别分数为结局变量，预测因素包括人口学特征、临床特征、激素水平及月经周期阶段等，并通过SHAPley加性解释（SHapley Additive exPlanation, SHAP）值评估变量重要性。
全样本分析显示，所有群体均成功完成FA和FE学习。在比较EF（低E2）和LF（高E2）女性时，两组在FPS、SCR和RR指标上均表现出成功的CS辨别，FA无显著组间差异。然而在FE阶段，LF女性在第3个Blocks时CS辨别消失，表明完全消退；而EF女性直至训练结束仍保持显著CS辨别。按E2中位数分组后，高E2组在SCR和RR指标上于第3个Blocks实现完全消退，低E2组则持续存在CS辨别，表明E2促进消退内FE。孕酮单独分析显示，高低孕酮组在FA和FE各指标上均无显著差异，提示孕酮单独作用不显著。
当考察孕酮/雌二醇比值（P/E2 ratio）时，传统方差分析未显示线性关系，但HGBRT机器学习分析揭示P/E2比值是预测人类FE期间SCR的CS辨别的重要变量之一，SHAP值显示P/E2比值与FE表现存在复杂非线性关联，且ML阶段女性的P/E2比值分布特征尤为突出。 ]]>在OCA与LF女性的比较中，两组均成功完成FA和FE，模式相似，支持外源性和内源性雌激素对恐惧学习具有可比效应的观点。阴道细胞学分类与基于周期长度的分类存在显著差异，LF阶段分类准确率最低（52.6%），提示间接周期分期方法的局限性。
小鼠实验结果与人类数据收敛。血浆E2水平与FE期间僵直行为呈正相关，而P/E2比值与僵直行为呈负相关，即高P/E2比值预测更少的僵直反应和更好的FE表现。HGBRT分析中，P/E2比值位列预测FE表现的 top 5变量之中。值得关注的是，FE训练本身导致血浆孕酮水平升高而E2水平降低，从而使P/E2比值上升，这一动态变化提示该比值可能是FE过程的神经内分泌相关标志而非静态基线特征。
综合人类和小鼠数据，E2对FE的促进作用在与孕酮的交互作用中得以增强，高P/E2比值预测增强的跨物种FE表现，提示该比值可作为恐惧消退的潜在转化生物标志物。
本研究聚焦于性类固醇激素对恐惧记忆修饰作用的神经生物学机制，在跨物种框架下系统探究了雌二醇与孕酮的动态交互对恐惧习得及消退内恐惧消退的调控效应，为理解性别差异在恐惧相关障碍中的病理生理学基础提供了新见解。
研究背景与问题提出：恐惧相关障碍如创伤后应激障碍（post-traumatic stress disorder, PTSD）、惊恐障碍及特定恐惧症以条件性恐惧习得与消退的异常为核心特征，且呈现显著的性别差异——女性PTSD终生患病率约为男性的两倍。既往研究多关注雌二醇对恐惧消退记忆巩固的调节作用，但对消退内恐惧消退的影响结论不一，孕酮的作用也尚未得到充分阐明。此外，口服避孕药对情绪学习的影响、月经周期分期的最佳方法、以及唾液激素检测的技术局限性等问题均制约着该领域的进展。月经周期阶段作为激素状态的间接指标，其与直接激素测量之间的一致性亦有待验证。
研究人员开展了什么研究：为回应上述问题，研究人员设计了一项人类实验和一项小鼠实验，采用直接（LC-MS/MS激素定量）与间接（月经周期/动情周期分期）相结合的方法，通过恐惧增强惊跳反应、皮肤电反应及主观风险评级等多模态指标，系统评估雌二醇、孕酮单独及联合作用对恐惧习得和消退内恐惧消退的影响，并创新性地引入机器学习分析方法捕捉激素间的非线性交互效应。人类被试涵盖男性、天然周期女性（按早期卵泡期、晚期卵泡期、黄体中期分组）及口服避孕药使用者；小鼠被试包括雄性和各动情周期阶段的雌性。研究还采用了一种基于阴道细胞学的新月经周期分类方法，并与传统基于周期长度的分类进行比对。
研究结论：主要发现包括：第一，高雌二醇水平促进消退内恐惧消退，但仅在孕酮的协同作用下效应最大化；第二，孕酮单独对恐惧习得和消退内恐惧消退均无显著主效应；第三，孕酮/雌二醇比值（P/E2 ratio）是预测恐惧消退的跨物种关键变量，高P/E2比值与增强的消退表现相关；第四，口服避孕药使用者与晚期卵泡期女性在恐惧 learning 模式上相似，提示合成雌激素与内源性雌激素具有可比的恐惧调节效应；第五，基于阴道细胞学的周期分类与基于周期长度的传统分类存在显著差异，尤其晚期卵泡期分类准确率较低。
研究重要意义：该研究首次将P/E2比值确立为恐惧消退的潜在转化生物标志物，突破了单一激素分析的局限，揭示了雌二醇和孕酮的交互作用在恐惧消退中的核心地位。这一发现为开发性别特异性的恐惧相关障碍干预策略提供了神经内分泌靶点，同时强调了在未来的恐惧条件反射研究中纳入激素复合指标和机器学习分析方法的重要性。跨物种验证的结果进一步增强了该生物标志物的临床转化价值。
关键技术方法：人类研究采用为期两天的延迟恐惧消退方案，结合皮肤电反应、恐惧增强惊跳反应和主观风险评级三种测量手段，通过LC-MS/MS对唾液样本进行雌二醇、孕酮等激素定量；月经周期分期综合了自我报告的末次月经日期和阴道细胞学评估。小鼠研究采用线索化恐惧条件反射范式，以僵直行为为恐惧指标，通过尾静脉采血和心脏采血获取血浆样本进行激素检测。数据分析采用重复测量方差分析和基于直方图的梯度提升回归树机器学习模型，辅以SHAPley加值解释方法进行变量重要性评估。
研究结果：人类群体特征与全样本恐惧 learning：128名参与者（95名女性，33名男性）中，女性按周期阶段或口服避孕药使用分组。全样本成功验证了两日方案的有效性，所有群体在恐惧习得和消退内恐惧消退中均表现出显著的条件刺激辨别，且群体间无显著差异。
雌二醇对恐惧习得和消退的作用：比较早期卵泡期（低雌二醇）和晚期卵泡期（高雌二醇）女性，恐惧习得阶段两组均成功学习且无组间差异。消退阶段，晚期卵泡期女性在第3个Blocks时条件刺激辨别消失，实现完全消退；而早期卵泡期女性持续存在辨别，提示雌二醇促进消退内恐惧消退。按定量雌二醇中位数分组后，高雌二醇组在皮肤电反应和主观风险评级上于第3个Blocks实现完全消退，低雌二醇组则持续辨别，进一步证实雌二醇的促进作用。
孕酮对恐惧习得和消退的作用：高低孕酮分组在恐惧习得和消退的所有指标上均无显著差异，表明孕酮单独对恐惧 learning 无显著影响。
孕酮/雌二醇比值的联合效应：传统方差分析未显示P/E2比值与恐惧 learning 的线性关系。但机器学习分析揭示，P/E2比值是预测消退内恐惧消退的关键变量之一，与皮肤电反应的条件刺激辨别存在复杂关联，黄体中期女性的数据分布尤为集中。
口服避孕药使用者的表现：口服避孕药使用者与晚期卵泡期女性在恐惧习得和消退内表现相似，均成功完成学习，支持合成与内源性雌激素具有可比效应的观点。
阴道细胞学分类验证：基于阴道细胞学的周期分类与基于周期长度的传统分类存在显著差异，晚期卵泡期分类准确率最低（52.6%），提示单纯依赖周期长度进行分期的局限性。
小鼠研究结果：小鼠实验复制了人类研究范式。血浆雌二醇水平与消退期间僵直行为正相关，P/E2比值与僵直行为负相关。机器学习分析中，P/E2比值位列预测消退表现的 top 5变量。值得注意的是，消退训练后血浆孕酮升高而雌二醇降低，导致P/E2比值上升，提示该比值可能反映消退过程的动态神经内分泌特征，而非静态基线指标。
讨论与结论部分翻译：本研究探究了月经周期和动情周期阶段及性类固醇激素波动对人类和小鼠恐惧习得及消退内恐惧消退的影响。研究整合了直接激素测量（LC-MS/MS类固醇定量）和间接评估（月经/动情周期阶段分配）方法。机器学习分析显示，P/E2比值是跨物种预测恐惧消退的主要变量之一，高比值预测增强的消退表现。总体而言，这些结果提示孕酮与雌二醇之间的新型跨物种交互作用调控恐惧加工，凸显了在研究记忆过程时考虑性别和性别相关变量之于理解恐惧相关障碍的重要性。
当前文献关于雌二醇对恐惧记忆作用的共识尚未达成。动物研究常报告雌二醇改善多种学习类型，包括空间记忆、工作记忆、物体识别以及线索化和情境恐惧条件反射等。然而，也有研究报道了相反效应。在恐惧记忆方面，人类研究指出高雌二醇与增强的恐惧消退回忆相关，但这些研究同样多次显示雌二醇对消退内恐惧消退无显著作用。相反，其他研究则报告了高雌二醇条件下的改善性消退内恐惧消退。此外，考虑创伤暴露的研究强调雌二醇对女性PTSD患者消退内恐惧消退的促进作用。
在本研究中，比较五个群体时未发现显著的群体影响。然而，聚焦于早期卵泡期（低雌二醇）和晚期卵泡期（高雌二醇）女性的分析显示，一个接近显著的交互作用提示与晚期卵泡期女性不同，早期卵泡期参与者似乎未能消退恐惧反应。按LC-MS定量雌二醇水平分析时，同样模式显现：低雌二醇参与者表现出受损的消退内恐惧消退学习，至训练结束时仍存在显著的条件刺激辨别；反之，高雌二醇参与者能够实现完全消退。动物实验中，类似于人类数据，比较五个群体时也未发现消退训练差异。聚焦于LC-MS定量激素水平时，未发现雌二醇或孕酮的单独或联合效应。
关于孕酮在恐惧条件反射中的作用，文献结论不一。不同发表文献显示孕酮对人类或小鼠的恐惧消退无显著影响。Pineles等（2016）发现PTSD女性黄体中期的消退回忆受损，提示激素与创伤的潜在交互作用。与文献一致，本研究结果亦显示孕酮对恐惧习得或消退内恐惧消退无显著影响。然而，数据的探索性观察提示黄体中期女性（以高孕酮为特征）可能存在消退内恐惧消退损害，表现为习得和消退阶段均缺乏条件刺激辨别。这一观察可能指出月经周期对恐惧学习存在超越激素直接影响的 subtle、多因素调节作用，有待进一步研究证实。
跨研究的结果暗示雌二醇和孕酮的潜在联合效应。因此，联合分析方法对于进一步理解恐惧学习的激素调控是最优选择。孕酮/雌二醇比值提供了衡量两种类固醇在个体内关系的指标，涵盖了其在月经周期中的独立波动。Milad等（2010）通过中位数分割和相关分析研究了P/E2比值对恐惧消退回忆的影响，但未发现显著结果。沿此思路，本研究在比较人类或小鼠高低P/E2比值时也未发现显著作用。然而，当采用更高复杂度的分析时，通过预测性机器学习方法能够展示P/E2比值的相关性。因此，这些发现提示P/E2比值不应被理解为简单的预测因子，而是一个其恐惧消退相关性最能通过捕捉非线性关系和交互作用分析工具揭示的变量。
在人类研究中，HGBRT模型中P/E2比值 ranked 为恐惧消退最重要变量之一。人类中高P/E2比值对皮肤电反应条件刺激辨别呈负面影响，提示较高比值与增强的消退学习相关。该模型进一步揭示了多种激素与人格特征如特质焦虑的复杂交互。动物实验中，P/E2比值的证据基于三个相互印证的发现：第一，P/E2比值与消退第二组僵直行为呈负相关，表明较高比值与较少僵直及更好消退相关；第二，HGBRT将P/E2比值列为平均僵直时间 top 5预测变量之一，与雌二醇和孕酮单独水平并列；第三，消退训练本身产生P/E2比值的显著后消退增加，由孕酮（升高）和雌二醇（降低）的相反变化所驱动，这与该比值作为消退过程神经内分泌相关标志而非单纯基线变量的概念一致。
人类与动物结果的主要差异在于动物实验中单独孕酮和雌二醇水平 ranked 为更高预测变量，这可能提示物种间下丘脑-垂体-性腺（hypothalamic-pituitary-gonadal, HPG）轴在消退期功能存在差异。
应激暴露已知改变激素状态，但文献结果矛盾。HPG轴激活刺激孕酮释放，因此其水平在应激后已知升高。相反，应激下雌二醇的动态并不明确，文献中可见矛盾结果。尽管恐惧习得和消退本身不被视为应激源，但恐惧条件反射过程已报告可诱发类似应激的生理反应。比较小鼠消退前后激素，观察到孕酮增加，这与应激文献一致。相反，雌二醇呈现相反模式，消退训练后血液水平下降。这种差异性变化转化为P/E2比值的增加，结合机器学习结果，可理解为消退过程的神经内分泌特征而非基线特征。
关于激素对恐惧学习的外源性影响，特别是口服避孕药的作用，既往研究显示口服避孕药可增强恐惧习得和消退记忆，而不同研究则报告了相反结果，将口服避孕药与受损的恐惧消退回忆相关联。鉴于合成雌激素可产生功能上模拟晚期卵泡期内源性雌二醇峰值的高循环雌激素水平，本研究预期口服避孕药使用者和晚期卵泡期女性具有相似的恐惧习得和消退内恐惧消退模式。尽管晚期习得和早期消退存在某些差异，但两组均表现出成功的习得和消退内恐惧消退，支持了合成与自然激素的恐惧调节效应相似的观点。
为间接评估月经周期阶段，研究人员根据阴道上皮细胞在不同周期阶段的细胞学特征进行参与者分类。然而，这一分类显示有限准确性，尤其晚期卵泡期分类准确率最低，可能源于周期阶段转换期的特征重叠。
解释本研究结果时需谨慎，因研究纳入两个物种，且激素定量来自不同介质（人类唾液和小鼠血液）。尽管如此，跨物种获得了相似发现，突显了结果的稳健性和可转化性。研究局限性包括仅纳入健康参与者，限制结果向临床人群的推广；口服避孕药使用者服用了不同类型和浓度的孕激素，这种治疗异质性应在解释结果时予以考虑。此外，实验范式使用了不同的感觉通道和刺激数量——人类使用视觉条件刺激，而小鼠使用单一听觉条件刺激。
综上，本研究凸显了孕酮和雌二醇比值在调节恐惧消退中的角色。研究发现先前报道的雌二醇对恐惧消退回忆的促进作用可能不限于消退记忆巩固；相反，雌二醇似乎在消退训练期间已表现出促进效应，且该效应被其与孕酮的联合影响所增强。动物实验复制了这一发现，进一步支持了孕酮和雌二醇交互作用在恐惧消退中的重要性，并强化了研究发现的跨物种可转化性。总体而言，这些发现填补了文献中的重要空白，凸显了激素交互作用对跨物种恐惧记忆的复杂调节，提示P/E2比值可成为记忆研究中的整合性因素，有助于减少研究间变异、改善结果比较，最终促进人类和动物研究中更一致、更可靠的发现。
