干涉散射显微镜技术支持实时、高分辨率的、无需标记的单分子免疫分析

《Scientific Reports》：Interferometric scattering microscopy supports real-time mass-resolved label-free single-molecule immunoassay

　　

摘要

蛋白质-蛋白质相互作用决定了免疫、信号传导和疾病过程中的生物分子机制。关联、解离和抑制的基本速率是我们理解生命过程的基础，同时也是治疗发现领域的一个限制因素。然而，现有的检测方法是通过集合平均信号或标记来间接推断这些过程，这些方法掩盖了蛋白质之间的自然动态。在这里，我们介绍了一种基于干涉散射显微镜（iSCAT）的无标记、实时、质量分辨的单分子免疫检测技术，该技术可以直接观察复杂生物样本中的单个蛋白质-蛋白质结合事件。通过检测单个蛋白质与抗体功能化表面结合时散发的光，我们能够以单分子灵敏度和分子量分辨能力来解析抗体-抗原之间的相互作用。以IgM作为模型系统，我们展示了单个结合事件的实时检测结果，其结合速率与浓度的关系呈线性关系，覆盖了三个数量级。通过对人类血清中IgM结合事件的直接计数，我们获得了与酶联免疫吸附测定（ELISA）结果一致的定量浓度数据。通过对单个结合和解离事件的空间分辨追踪，我们从单分子停留时间的分布中获得了基本解离速率常数\(k_{\textrm{off}}\)。这种生物亲和性iSCAT平台结合了分子特异性、无标记检测、实时动力学和质量分辨的单分子灵敏度，为定量单分子免疫检测提供了一个通用框架。