无标记成像和机器学习技术揭示了由周期蛋白依赖性激酶6（CDK6）调控的代谢表型以及单个前脂肪细胞中的“米色潜能”（beige potential）

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Label-free imaging and machine learning reveal cyclin-dependent kinase 6 (CDK6)-regulated metabolic phenotypes and beige potential in single preadipocytes

　　

周一轩|徐月琳|程思瑶|倪新涛|张璐|张欣|侯晓丽|夏道宗

浙江中医药大学药学院，中国杭州310053

摘要

周期依赖性激酶6（CDK6）调节脂肪生成和米色脂肪的形成，但其在前脂肪细胞代谢中的作用尚不清楚。小鼠胚胎成纤维细胞系3T3-L1是一个公认的前脂肪细胞模型，在脂肪生成刺激下具有较高的脂肪生成潜力。在这里，我们使用无标记、非侵入性的拉曼成像技术在单细胞水平上研究了CDK6敲除（KO）后3T3-L1细胞的代谢特征。为了提高光谱解释的准确性，分别使用分离的细胞线粒体和小鼠皮肤组织作为线粒体和胶原蛋白拉曼特征的参考标准。通过对拉曼高光谱数据应用真成分分析（TCA），将复杂的光谱信号分解为具有相应空间分布的不同的生化成分。与野生型（WT）细胞相比，CDK6的缺失增加了线粒体含量和不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例，但降低了胶原蛋白和总脂质含量。这些变化表明，CDK6的缺失促进了线粒体代谢并抑制了细胞外基质的合成，从而赋予了有利于向米色脂肪细胞分化的代谢变化。四种拉曼光谱生物标志物（I809/937、I754/2918、I937/1585、I1244/1444）能够有效区分不同细胞类型。对于高光谱数据处理，我们采用了一种基于机器学习的流程，包括预处理（基线校正和标准化）、通过主成分分析（PCA）进行降维，以及使用多种算法进行分类。其中，线性判别分析（LDA）模型在区分WT和KO细胞时达到了98.3%的最高分类准确率。这项研究表明，拉曼光谱不仅能够在单细胞水平上进行无标记的代谢表型分析，还为预测脂肪细胞分化命运提供了一个新的平台。

引言

肥胖是一种慢性且复杂的疾病，其特征是脂肪组织过度扩张，这对全球公共卫生产生了深远影响[1]、[2]。脂肪组织的主要细胞类型是脂肪细胞，它们的失调是肥胖及其相关疾病的核心原因[3]。根据形态和功能差异，脂肪细胞被分为白色、棕色和米色三种类型[4]。白色脂肪细胞主要以甘油三酯的形式在大脂滴（LDs）中储存能量，并分泌多种调节代谢的因子[5]。棕色脂肪细胞具有较小的脂滴和丰富的线粒体，主要由于线粒体解偶联蛋白1（UCP1）的作用而具有较高的产热能力[6]。米色脂肪细胞具有与棕色脂肪细胞相似的特性，也通过产热来促进能量消耗[5]。米色脂肪细胞在白色脂肪组织（WAT）中通过寒冷暴露、药物干预或运动诱导产生，这一过程被称为“褐变”或“米色化”，并且在去除刺激后是可逆的[5]、[7]、[8]。米色脂肪细胞的诱导和表型维持代表了一种对抗肥胖的潜在治疗策略。米色脂肪细胞的来源有两种方法：一种来自WAT基质血管部分（SVF）中的脂肪前体细胞（APCs），另一种来自已存在的成熟白色脂肪细胞。APCs有两种主要的细胞命运：脂肪生成或纤维生成，分别导致脂肪细胞或肌成纤维细胞表型[9]、[10]。脂肪生成的APCs富含线粒体基因，而具有抗脂肪生成能力的纤维生成前体细胞则表现出与细胞外基质（ECM）重塑和炎症相关的基因丰富[11]。寒冷暴露或过表达PR结构域包含16（PRDM16，一种关键的米色脂肪细胞激活因子）可以促进线粒体活性，并抑制ECM蛋白和WAT的纤维炎症[12]、[13]。此外，抑制APCs的肌纤维生成编程有助于米色细胞的分化[14]。脂肪生成的APCs首先进入前脂肪细胞阶段，然后生成白色脂肪细胞或米色脂肪细胞[9]。尽管前脂肪细胞具有较高的脂肪生成潜力，但它们分化为米色或白色脂肪细胞的能力仍不清楚。前脂肪细胞中的线粒体活性和纤维生成基因表达也可能参与决定其分化为米色或白色脂肪细胞，这与APCs向米色细胞的转变一致。

3T3-L1细胞系来源于瑞士白化小鼠胚胎成纤维细胞，是有效的体外脂肪细胞分化模型[15]。该模型具有高同质性和稳定的增殖能力，消除了SVF中内皮细胞和免疫细胞的干扰，专注于前脂肪细胞特异性机制[15]、[16]。在3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、地塞米松和胰岛素等分化诱导剂的刺激下，前脂肪细胞逐渐积累脂滴，减少胶原蛋白，并最终表现出典型的成熟脂肪细胞形态[17]、[18]。虽然3T3-L1前脂肪细胞主要分化为白色脂肪细胞，但在特殊条件下（如激活sirtuin 1（SIRT1）、过氧化物酶体增殖激活受体γ共激活因子1-α（PGC-1α）和转录因子PRDM16）的作用下，它们可以被诱导形成米色脂肪细胞[19]。

周期依赖性激酶6（CDK6）不仅驱动细胞G1/S期的进展，还控制WAT中的新脂肪生成和米色脂肪细胞的生物发生[20]、[21]、[22]。CDK6缺乏通过促进前体细胞的新脂肪生成和成熟白色脂肪细胞的转分化来驱动米色细胞的形成[21]。抑制CDK6可以诱导前脂肪细胞在脂肪生成刺激后分化为米色脂肪细胞[23]。然而，以往的研究主要集中在CDK6在成熟白色或米色脂肪细胞中的作用；其对前脂肪细胞的影响仍需进一步探索。CDK6对前脂肪细胞化学组成的改变可能会影响其分化潜力。因此，检测CDK6缺乏型和野生型（WT）前脂肪细胞之间的组成差异对于理解它们分化为白色或米色细胞的决策非常重要。

拉曼显微镜结合了显微镜技术和拉曼光谱技术，用于生物样本的化学组成和结构评估，由于其无标记、非侵入性、高灵敏度和特异性而在单细胞表型分析中表现出优越性[24]、[25]。除了生成蛋白质、脂质和核酸等生物分子的特定振动光谱外，拉曼显微镜还可以显示细胞化学成像[26]、[27]。尽管来自WAT和棕色脂肪组织（BAT）的SVF细胞具有不同的分化潜力，但它们相应分化的脂肪细胞中的光谱变化很小，部分归因于使用了相同的分化方案[28]。因此，仍需进一步研究未分化的脂肪前体细胞或前脂肪细胞的鉴定，以阐明它们的谱系归属。最近的一项拉曼光谱分析比较了缺乏CDK6的HeLa细胞和WT对照组，发现CDK6的缺失导致脂滴的不饱和度增加，以及线粒体和内质网的信号强度增强[24]。那么，在CDK6缺失的情况下前脂肪细胞会发生怎样的变化呢？这对确定米色细胞的分化是否有帮助？为了解决这些问题，我们首先从分离的细胞线粒体部分获得了线粒体的参考拉曼光谱，并从体外小鼠皮肤组织获得了胶原蛋白的参考光谱，从而能够准确分配这两种成分的光谱特征。在这项研究中，我们使用拉曼显微镜系统地分析了CDK6缺失后3T3-L1前脂肪细胞的化学组成和表型变化。我们的目的是为阐明CDK6在前脂肪细胞中的作用提供理论和技术支持，特别是早期预测米色细胞分化潜力。

章节片段

细胞培养和线粒体分离

3T3-L1（RRID: CVCL_0123）来自美国类型培养集（ATCC，马里兰州罗克维尔）。使用CRISPR/Cas9方法生成了CDK6敲除（KO）的3T3-L1前脂肪细胞[21]、[29]。3T3-L1细胞在含有4.5g/L葡萄糖的高葡萄糖DMEM培养基中培养（含10% FBS和1% P/S），并在5% CO2气氛下于37°C孵育。当细胞达到70–80%的汇合度时，用0.25%的trypsin-EDTA处理1分钟，然后进行传代培养。

CDK6缺乏改变了前脂肪细胞的生化组成和亚细胞结构

为了建立评估CDK6功能的模型，我们首先构建了CDK6 KO的3T3-L1前脂肪细胞[23]。虽然明场成像没有显示出明显的形态变化（图1A），但免疫印迹分析证实了CDK6蛋白表达的显著减少（图1B），验证了我们的敲除策略的有效性。

接下来，我们使用无标记拉曼光谱分析了CDK6缺失对细胞内大分子组成和分布的影响。

讨论

在这项研究中，我们结合了无标记拉曼光谱和化学计量分析来研究CDK6敲除对前脂肪细胞代谢的影响。由于生物分子的贡献重叠，单峰拉曼分配可能过于简化；因此，我们采用了多峰、参考支持的TCA和成像整合策略来确保光谱解释的准确性。我们的结果表明，CDK6缺乏增加了线粒体含量和不饱和脂肪酸（UFA）的丰度，同时减少了...

CRediT作者贡献声明

周一轩：撰写原始草稿、验证、方法学、研究、数据管理。徐月琳：方法学、研究。程思瑶：正式分析、数据管理。倪新涛：验证、软件。张璐：软件、数据管理。张欣：验证、软件。侯晓丽：撰写-审稿与编辑、监督、资金获取、概念化。夏道宗：监督、研究、资金获取。

作者声明

所有列出的作者都必须对这项工作做出贡献并批准手稿。该手稿是原创的，目前尚未提交给其他期刊进行评审。

资助

这项工作得到了国家自然科学基金（编号：82374169、82074085）和2025年浙江中医药大学研究生顶尖创新人才培养计划（编号：2025YJSBJ004）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢余晓峰在本工作期间提供的宝贵技术协助和有益讨论。