利用神经激肽-1受体拮抗剂阿瑞匹坦通过线粒体驱动的坏死性凋亡清除复发/难治性急性淋巴细胞白血病

《Cancer Letters》：Repurposing the Neurokinin-1 Receptor Antagonist Aprepitant to Eradicate Relapsed/Refractory Acute Lymphoblastic Leukemia via Mitochondria-Driven Necroptosis

　　

复发/难治性急性淋巴细胞白血病（R/R ALL）的预后因内在及获得性化疗耐药而极差，亟需新型治疗策略。神经激肽-1受体（NK-1R）作为新兴肿瘤靶点，其在ALL中的作用及治疗潜力尚不完全明确。本研究发现，NK-1R在原发性及复发/难治性ALL中显著过表达，是一个强有力的治疗靶点。美国食品药品监督管理局（FDA）批准的NK-1R拮抗剂阿瑞匹坦（Aprepitant）可有效抑制ALL细胞增殖，并在患者来源样本及多柔比星耐药细胞系中克服化疗耐药。机制上，阿瑞匹坦触发了一条新型线粒体驱动的坏死性凋亡（necroptosis）通路，有别于研究人员此前报道的NK-1R阻断在其他癌症中诱导的凋亡。该通路始自内质网（ER）钙离子释放及内质网应激，继而引起线粒体钙超载、活性氧（ROS）爆发及随后的线粒体分裂，最终激活核心坏死性凋亡效应分子RIP1、RIP3和MLKL的磷酸化。药理学抑制坏死性凋亡、内质网应激或线粒体ROS均可显著减弱阿瑞匹坦诱导的细胞死亡。重要的是，阿瑞匹坦在异种移植小鼠模型中显示出显著的体内抗白血病效应。这些发现不仅阐明了NK-1R抑制所激活的独特线粒体介导的坏死性凋亡机制，还为立即将阿瑞匹坦临床 repurposing（老药新用）作为R/R ALL靶向治疗提供了有力依据。

急性淋巴细胞白血病（ALL）是最常见的儿童及青少年血液系统恶性肿瘤，以B细胞前体急性淋巴细胞白血病（BCP-ALL）或T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）来源的淋巴祖细胞异常克隆性扩增为特征。尽管当代治疗方案使初诊病例获得了显著缓解率，但复发或难治性（R/R）ALL患者的预后仍极差，约20%的确诊患者经历复发，约10%最终死于该病。这一严峻现实凸显了识别新型治疗靶点、开发有效药物以克服R/R ALL治疗耐药性的迫切临床需求。

神经激肽-1受体（NK-1R）是G蛋白偶联受体（GPCR），其天然配体为P物质（Substance P, SP）。NK-1R的传统功能是在化疗中介导恶心呕吐反应，而阿瑞匹坦作为高选择性、高特异性的NK-1R拮抗剂，是FDA批准的临床广泛使用的止吐药物。近年研究表明，NK-1R在多种实体瘤和血液肿瘤中参与肿瘤进展、增殖和存活。研究人员前期工作已证实NK-1R在髓系白血病和结直肠癌患者中高表达，且NK-1R拮抗剂的抗肿瘤效应具有肿瘤类型特异性：在髓系白血病中通过线粒体钙超载和氧化应激诱导凋亡；在结直肠癌中则主要通过内质网（ER）应激诱导凋亡，而无显著线粒体参与。此外，研究人员还证实NK-1R阻断可致敏结直肠癌细胞至常规化疗并克服化疗耐药，相关临床前数据已推动一项正在进行的NK-1R拮抗剂联合化疗及贝伐珠单抗治疗晚期结直肠癌的前瞻性、随机、双盲、多中心II期临床试验。

尽管有研究提示NK-1R拮抗剂在有限的ALL细胞系中具有抗增殖效应，但NK-1R在原发性ALL患者样本（尤其在R/R疾病治疗背景下）过表达的临床相关性尚待探索，且阿瑞匹坦抗ALL活性的精确分子机制亦不明确。

本研究中，研究人员系统阐明了NK-1R在ALL中的临床相关性及阿瑞匹坦的治疗潜力。首先，通过分析公共基因表达综合数据库（GEO数据集），发现TACR1（编码NK-1R的基因）mRNA在ALL患者骨髓和外周血中较健康供体显著上调。在费城染色体阳性（Ph+）B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）患者中，NK-1R高表达者倾向于具有较短总生存期。免疫组织化学检测证实，NK-1R蛋白在19例ALL患者（10例初诊、9例R/R）的外周血和骨髓样本中均呈阳性表达，而7例健康供体中均未检测到。Western blot进一步验证NK-1R在Nalm6（B-ALL）和Jurkat（T-ALL）细胞系中的蛋白表达高于正常白细胞。

基于上述发现，研究人员进一步探究了阿瑞匹坦的功能效应。11例ALL患者（6例初诊、5例R/R）的原发性骨髓和外周血单个核细胞经阿瑞匹坦处理后，呈现剂量依赖性增殖抑制，且对初诊和R/R样本的效力相当。通过shRNA介导的NK-1R敲低及后续回补实验，证实了靶向NK-1R的功能特异性。研究人员还建立了耐多柔比星（DOX）的ALL细胞系Nalm6/DOX，该细胞系对DOX的IC₅₀值升高约18倍，并上调多药耐药相关蛋白（ABCC1、P-gp、ABCG2）表达。阿瑞匹坦对亲本和DOX耐药Nalm6细胞均表现出强效的剂量和时间依赖性增殖抑制，且与DOX和柔红霉素（DNR）具有协同作用，但与阿糖胞苷（Ara-C）和长春新碱（VCR）无协同效应。关键的是，阿瑞匹坦联合处理使Nalm6/DOX细胞对DOX重新敏感，并下调耐药相关蛋白表达。

在体内疗效方面，NOD-SCID小鼠经尾静脉注射Nalm6-luc-GFP细胞建立异种移植模型后，阿瑞匹坦（30 mg/kg）治疗显著降低白血病负荷，表现为生物发光信号减弱、骨髓中人CD19⁺细胞比例下降及生存期延长，且未观察到显著体重差异。

在细胞死亡方式鉴定方面，研究人员发现阿瑞匹坦诱导的是坏死性凋亡而非凋亡。Annexin V/碘化丙啶（PI）染色显示PI阳性坏死细胞显著增加，扫描电子显微镜观察到细胞肿胀、胞质孔扩大及内容物释放等典型坏死形态。机制上，阿瑞匹坦快速诱导RIP1、RIP3和MLKL的磷酸化，而不改变其总蛋白水平。坏死性凋亡抑制剂Nec-1和NSA、RIP3或MLKL敲低可挽救细胞死亡，而凋亡抑制剂（Z-VAD-FMK）、铁死亡抑制剂（Fer-1）、晚期自噬抑制剂（Bafilomycin A1）和自噬-溶酶体抑制剂（氯喹）均不能挽救，确证了坏死性凋亡机制。

进一步机制研究揭示，阿瑞匹坦触发内质网钙释放和未折叠蛋白反应（UPR）。活细胞成像显示阿瑞匹坦快速诱导胞质钙持续升高，继之发生线粒体钙超载。同时，阿瑞匹坦激活UPR的全部三条通路：蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）和真核翻译起始因子2α（eIF2α）的磷酸化、XBP1 mRNA剪接（提示肌醇需求蛋白1α/IRE1α激活）、以及激活转录因子6（ATF6）的切割。药理学抑制PERK（GSK2606414）、全局性内质网应激（Guanabenz Acetate, GUA）或线粒体钙摄取（DIDS），以及siRNA敲低PERK、IRE1和线粒体钙单向转运体（MCU），均可显著减弱阿瑞彼坦诱导的细胞死亡，将内质网应激及其后的线粒体钙通量定位于坏死性凋亡的上游。

线粒体事件方面，阿瑞匹坦诱导时间依赖性的线粒体活性氧（mtROS）快速增加。DIDS预处理可消除mtROS爆发，确立钙超载为其触发因素。透射电子显微镜（TEM）显示阿瑞匹坦促进线粒体分裂，增加线粒体数量和体积，伴随分裂蛋白Fis1表达上调和DRP1磷酸化增加，以及线粒体碎片化和嵴稀疏化、空泡化。线粒体靶向抗氧化剂MitoQ和氧化应激诱导坏死抑制剂IM-54均可挽救细胞活力，并抑制RIP1/RIP3/MLKL的磷酸化，直接将mtROS与坏死性凋亡执行相联系。机制探索发现，线粒体复合物V（ATP合酶）抑制剂寡霉素较其他电子传递链复合物抑制剂更能协同增强阿瑞匹坦诱导的mtROS产生，提示氧化磷酸化在传递坏死性凋亡信号中的特定作用。

讨论部分，研究人员指出尽管前线治疗取得进展，R/R ALL预后仍差，主要源于治疗耐药克隆的出现。已有证据将NK-1R定位为有前景的可成药肿瘤靶点，而FDA批准的高亲和力拮抗剂如阿瑞匹坦和福沙匹坦为快速转化其抗肿瘤潜力至临床实践提供了独特机遇。本研究显著拓展了NK-1R靶向的治疗格局，证明其在原发性和R/R ALL中的显著疗效，结合前期在急性髓系白血病（AML）中的发现，巩固了将NK-1R拮抗剂 repurposing 用于白血病治疗的依据。

研究的核心发现是NK-1R阻断所激活的肿瘤类型特异性细胞死亡机制。研究人员此前报道NK-1R拮抗剂在髓系白血病和结直肠癌中诱导经典凋亡，但途径不同：前者依赖线粒体氧化应激，后者主要依赖内质网应激而无显著线粒体功能障碍。本研究则揭示了第三种、全新的机制：在ALL中诱导坏死性凋亡。这种由RIP1-RIP3-MLKL轴执行的调控性坏死，为克服肿瘤细胞对凋亡的频繁耐药提供了战略优势。

内质网是这一坏死性凋亡级联的关键启动者。内质网钙释放及后续UPR三条传感器通路（IRE1α、PERK和ATF6）的激活，定位于线粒体事件和坏死性凋亡执行的上游。慢性内质网应激可导致凋亡或坏死性凋亡，取决于癌症相关下游分子事件的激活。线粒体钙超载作为关键连接环节，驱动ROS爆发并促进线粒体分裂，这些事件对坏死性凋亡的完全执行至关重要。过载的线粒体钙可能结合ATP合酶，形成通透性转换孔并阻止ATP合成，从而促进ROS生成，这可解释ATP合酶抑制剂增强阿瑞匹坦mtROS诱导效应的现象。线粒体靶向抗氧化剂MitoQ抑制ROS产生和RIP1/RIP3/MLKL磷酸化的发现，牢固确立了mtROS不仅是副产物，而是该坏死性凋亡通路中的关键信号分子。这一内质网-线粒体-ROS轴代表了通往坏死性死亡的新途径，有别于TNFα信号等其他已确立的触发因素。

阿瑞匹坦对R/R ALL患者原代细胞的效力、使DOX耐药细胞重新化疗敏感的能力，以及其强效的体内抗白血病活性，共同为其临床repurposing提供了有力依据。阿瑞匹坦作为止吐药已在数百万患者中建立了良好的安全性 profile，这可显著加速其向ALL临床应用的转化路径。靶向NK-1R代表了一种新颖策略，可间接利用癌细胞对内质网和线粒体应激的脆弱性，提供了有别于常规化疗的治疗途径。

研究结论指出，该研究不仅明确了NK-1R是ALL中的临床相关靶点，还阐明了其拮抗剂阿瑞匹坦通过新型线粒体驱动的坏死性凋亡机制发挥强效抗白血病效应。这项工作从根本上推动了对癌症中NK-1R信号的理解，并为立即开展阿瑞匹坦的临床 investigation，特别是在亟需新疗法的高危R/R ALL患者人群中，提供了强有力的机制和临床前基础。