《Carbohydrate Polymers》：From crude extracts to purified fractions: Tracking sulfate preservation, antioxidant loss, and nanostructures by X-ray scattering of Hokkaido brown algae fucoidans
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熊谷勇也 | 马丁·阿兰·穆内·穆内 | 秋田信吾 | 西尔贾·萨吉万 | 佐藤敏文 | 磨佐康之 | 川越千春 | 高见隆芳 | 汤口良明 | 汤口良明 | 韦兰努奇·朗北海道大学渔业科学学院，日本北海道函馆市，041-8611摘要岩藻多糖在食品和治疗应用方面显示出潜力；然而，
熊谷勇也 | 马丁·阿兰·穆内·穆内 | 秋田信吾 | 西尔贾·萨吉万 | 佐藤敏文 | 磨佐康之 | 川越千春 | 高见隆芳 | 汤口良明 | 汤口良明 | 韦兰努奇·朗
北海道大学渔业科学学院，日本北海道函馆市，041-8611
摘要
岩藻多糖在食品和治疗应用方面显示出潜力；然而，由于纯化不足，其成分不稳定且生物活性被过度夸大。本研究严格分离了来自日本北海道的八种褐藻，使用阴离子交换色谱法得到三个主要组分（FN1、FN2和FN3）。虽然分离过程增加了硫酸盐含量，但测得的抗氧化活性降低了90%以上。多变量分析表明，硫酸盐和糖类含量之间的相互作用是导致这种残余活性的主要因素。随后，将Makombu藻提取的FN3进行酶解处理，再用活性炭处理并超滤，得到FN3 UF，其硫酸盐含量为48.9%，葡萄糖醛酸含量可忽略不计（通过高效阴离子交换色谱法及脉冲安培检测确定）。总体结果表明，通常报道的高活性主要是由共提取的杂质引起的，而真正的内在活性非常低（约1 μg/mg）。同步辐射小角X射线散射显示，这种纯化过程使Bragg距离从12.6 nm（富含藻酸盐的FN1）扩大到21.7 nm（硫酸化的FN3），首次提供了直接证据，证明硫酸盐驱动的静电排斥作用控制着岩藻多糖在溶液中的纳米结构。这些发现建立了前所未有的物理基础，证明严格的化学纯化是可靠评估岩藻多糖结构-功能关系的必要前提。
引言
褐藻长期以来一直作为主食在亚洲沿海地区食用，并用于传统医药。它们含有多种生物活性化合物，包括单宁、多酚、多糖（如岩藻多糖和藻酸盐）和色素。其中，岩藻多糖是一种硫酸化多糖，因其广泛的生物活性而受到关注，包括抗肿瘤、免疫调节（Apostolova等人，2020；Oliveira等人，2020；Wu等人，2016）、抗病毒、抗凝血（Prokofjeva等人，2013）、抗氧化、抗炎和抗糖尿病作用（Luthuli等人，2019；Olasehinde等人，2019），这些作用主要归因于硫酸基团。在含岩藻糖的硫酸化多糖中，岩藻多糖是一种复杂的杂聚物，主要由L-岩藻糖骨架组成，通常在C-2或C-4位置硫酸化，并含有不同比例的半乳糖、木糖、鼠李糖和葡萄糖醛酸（GlcA）（Deniaud-Bou?t等人，2017；Li等人，2008）。GlcA被认为是导致不同褐藻物种间分子异质性高的内在结构单元（Ponce & Stortz，2020）。岩藻多糖的化学组成受地理位置、季节、提取方法和收获时间的影响（Mak等人，2013），而结构特征决定了其生物活性。这些结构-功能关系对于岩藻多糖在功能性食品中的应用至关重要。然而，丰富的生物量使其能够大规模生产用于草药，但区域海藻的粗提物受到酚类污染，掩盖了由硫酸盐驱动的内在活性，从而影响了其治疗应用。目前从褐藻中提取岩藻多糖的主要方法是热水或热液法，常辅以微波或超声波以提高产量（Perumal等人，2025）。虽然这些高能量方法能有效破坏坚固的细胞壁，但经常会导致非目标物质（包括其他多糖和大量酚类化合物）的共提取。这些酚类杂质往往因物理和化学原因滞留在岩藻多糖的分子结构中而无法去除。标准处理方法（如氯化钙沉淀）专门用于去除藻酸盐，但通常不足以清除这些紧密结合的酚类化合物。
抗氧化剂对于维持生物和食品系统的氧化还原平衡和防止氧化损伤至关重要（Louren?o等人，2019）。尽管岩藻多糖因其硫酸盐密度和分子量而被认为具有清除自由基和还原铁的能力（Mensah等人，2023；Veena等人，2007），但这些评估通常基于粗提物，其中共提取的酚类和多糖（如藻酸盐）可能干扰生物活性测量（Bittkau等人，2020）。我们假设严格的纯化将揭示传统报道的高活性主要是由杂质引起的。相反，残余活性将反映真正的结构决定因素，如糖类和硫酸基团之间的相互作用。此外，保留的硫酸盐结构预计仍将是岩藻多糖在溶液中纳米结构的主要决定因素。
为了验证这一假设，我们研究了来自日本北海道南部的八种褐藻，这里是海藻生产和工业发展的主要中心。选择这些特定物种基于当地传统（如Makombu Saccharina japonica，一种地区性主食）和经济创新（如Gagome Kjellmaniella crassifolia，在函馆湾地区被开发为高价值品牌）。除了它们的烹饪价值外，这八种物种还用于在三个主要目（Laminariales、Fucales和Ralfsiales）之间进行系统的分类比较。这种多样性对于证明我们纯化协议的普遍适用性至关重要，因为这些目具有显著不同的多糖组成，从Laminariales的富含藻酸盐的细胞壁到Fucales和Ralfsiales的富含岩藻多糖的结构。岩藻多糖组分通过阴离子交换色谱法纯化，该方法已被证明能有效分离岩藻多糖与其他共提取成分（如藻酸盐、层粘连蛋白和酚类化合物）（Sichert等人，2021）。所得组分随后从化学组成（硫酸盐、糖类和岩藻多糖含量）和抗氧化活性方面进行了表征，以阐明结构-功能关系。多变量分析（包括主成分分析PCA和线性回归）被用来探索结构特征与生物活性之间的相关性。
选择岩藻多糖和硫酸盐含量高的组分作为代表性模型，并通过藻酸盐裂解酶消化、活性炭处理和超滤进一步纯化，以便进行详细的结构分析。使用同步辐射小角X射线散射（SAXS）探测纳米结构组织，提供了物理证据，证明在纯化过程中硫酸盐驱动的静电排斥和空间排列发生变化。这种综合方法明确了抗氧化活性是内在的还是由杂质引起的，并为食品和治疗应用中的可重复生物活性奠定了基础。
章节片段
化学物质和材料
由于篇幅限制，本节已移至支持信息部分。
藻类采集
从日本北海道南部的沿海地区采集了八种褐藻，代表三个目：Fucales（Fushisujimoku Sargassum confusum；Akamoku Sargassum horneri；Umitoranoo Sargassum thunbergii；Uganomoku Stephanocystis hakodatensis）、Ralfsiales（Matsumo Analipus japonicusAlaria crassifolia；Gagome Kjellmaniella crassifolia；Makombu Saccharina
八种褐藻的CF和粗藻酸盐产量
藻酸盐和岩藻多糖是褐藻细胞壁的主要成分，对其结构和功能特性有重要影响。这两种多糖常形成水溶性互聚物复合物，使其纯化复杂（Sichert等人，2021）。在本研究中，使用CaCl2沉淀藻酸盐后进行干燥（图1b）。CF和粗藻酸盐的产量如图1c所示。
结论
本研究表明，严格的纯化能够更准确地评估来自日本北海道南部褐藻的岩藻多糖的物理化学多样性和硫酸盐驱动的抗氧化特性。标准化的纯化方案结合活性炭处理有效去除了藻酸盐和酚类化合物等杂质，同时保留了内在的硫酸盐含量和抗氧化活性。对Makombu组分的电荷分离分析显示
CRediT作者贡献声明
熊谷勇也：撰写——初稿、可视化、项目管理、资金获取、数据管理、概念构思。马丁·阿兰·穆内·穆内：撰写——审阅与编辑、验证、概念构思。秋田信吾：资源提供、调查。西尔贾·萨吉万：正式分析。佐藤敏文：验证、监督。磨佐康之：撰写——审阅与编辑、资金获取。川越千春：资源提供、调查。高见隆芳：验证、资源提供。汤口良明：
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
SAXS实验得到了Photon Factory计划顾问委员会（提案编号2024G113，Y. Yuguchi，束流时间申请人）的批准。本工作得到了区域大学和地方工业Vitalization资助项目（日本内阁府函馆市，2022年3月）、JSPS J-PEAKS计划“从天然材料中探索独特性质的软材料平台”的支持
