《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Development of rapid multiplex human herpesvirus detection systems based on recombinase polymerase amplification and a lateral flow assay
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人疱疹病毒(Human herpesviruses, HHVs)在全球范围内高度流行，例如爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus, EBV)感染率超过95%，可在宿主细胞内终身潜伏，并在免疫抑制状态下重新激活，引发失明、脑炎甚至新生儿致死性感
人疱疹病毒(Human herpesviruses, HHVs)在全球范围内高度流行，例如爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus, EBV)感染率超过95%，可在宿主细胞内终身潜伏，并在免疫抑制状态下重新激活，引发失明、脑炎甚至新生儿致死性感染等严重疾病。在移植医学中，HHV再激活可导致移植物排斥、继发感染及死亡率升高。潜伏感染的细胞无明显病理变化，其进入细胞培养会造成实验数据偏差、生物制品安全隐患及公共卫生风险。本研究构建了三种检测系统：八重PCR系统，灵敏度为每50 μL反应体系1 × 104拷贝，适用于细胞样本的高通量污染筛查（在30份测试样本中检出1例EBV阳性）；四重RPA系统，灵敏度提升至每50 μL反应体系1 × 103拷贝（较PCR提高10倍），反应时间缩短至15–20分钟，适合快速初筛；双重RPA-LFA检测系统，保持同等灵敏度，可在20分钟内实现无需复杂仪器的可视化结果判读，用于现场快速鉴定。这些系统为细胞质量控制、HHVs相关疾病早期诊断及防控策略提供了可靠工具，也为其他病毒检测体系的开发提供了理论参考，具有广阔的应用前景。
本研究发表于《Frontiers in Cell and Developmental Biology》，针对人疱疹病毒（HHVs）在细胞培养及临床移植等领域的潜伏感染、共感染及检测难题展开。当前细胞培养过程中，病毒污染因难以检测和清除，会严重影响实验结果可靠性并带来生物安全隐患；HHVs可在原发感染后终身潜伏，并在应激或免疫抑制条件下再激活，造成细胞代谢紊乱、病变效应及恶性转化风险，且不同亚型常发生协同作用加重病情。现有检测方法如病毒分离耗时较长，血清学检测无法区分潜伏与活动性感染，单一核酸检测难以满足多重筛查需求。为此，研究人员开发了三种基于核酸扩增的检测系统，分别适配实验室高通量筛查、快速现场初筛和无仪器可视化检测的需求，实现了对八种HHVs的高效识别，为细胞库质量控制和临床即时诊断提供了技术支持。
在技术方法上，研究人员首先选取八种HHVs的保守基因片段设计引物，构建标准质粒并建立八重PCR体系；随后基于等温扩增原理，采用两种商业化试剂盒优化建立了两组四重重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification, RPA）系统；进一步结合侧向层析检测（Lateral Flow Assay, LFA）技术，引入探针消除非特异性信号，建立双重RPA-LFA可视化检测平台。所有体系均在中国典型培养物保藏中心（China Center for Type Culture Collection, CCTCC）提供的细胞系和病毒样本上进行验证，并评估灵敏度、特异性及实际应用性能。
在结果部分，八重PCR检测系统的建立与优化显示，经退火温度与引物浓度优化后，该系统可在单管反应中同时检测HSV-1、HSV-2、水痘-带状疱疹病毒（Varicella-Zoster Virus, VZV）、EBV、人巨细胞病毒（Human Cytomegalovirus, HCMV）、HHV-6、HHV-7和HHV-8，最低检测限为每50 μL体系1 × 104拷贝（HHV-7为1 × 103拷贝）。在30份CCTCC细胞系检测中，结果与已知数据一致，证明其在细胞库筛查中的可行性。四重RPA检测系统的建立与优化表明，由于多重RPA引物竞争效应，八重体系难以实现稳定扩增，因此将八种病毒分为两组，分别采用不同试剂盒优化条件，最终在41°C下15–20分钟即可完成扩增，灵敏度达到每50 μL体系1 × 103拷贝，比PCR提高10倍，且在30份细胞系检测中与PCR结果完全一致。双重RPA-LFA检测系统的建立与优化显示，通过在探针而非引物上标记荧光基团，成功消除了假阳性信号，最佳反应条件为39°C、15分钟，灵敏度与RPA相当，可在侧向层析条上实现HCMV与HHV-6的快速可视化判读，阴性对照无非特异显色。
在讨论与结论部分，研究人员指出，这三种检测系统分别覆盖了实验室高通量筛查、常规快速检测和资源有限环境下的现场检测需求，填补了现有HHVs多重检测技术的空白。与已有方法相比，八重PCR可一次性覆盖全部HHVs，四重RPA显著缩短检测时间并提高灵敏度，双重RPA-LFA无需复杂仪器即可获得直观结果。未来的优化方向包括引入探针实现定量检测、简化RPA反应组分以提高多重能力、在复杂临床样本中验证性能，以及扩展LFA检测目标数量。总体而言，本研究不仅为细胞培养质量控制提供了高效工具，也为其他潜伏病原体的多重检测系统开发提供了理论与技术参考，有助于推动生物医药产业在安全与效率方面的提升。
