阿尔茨海默病iPSC衍生小胶质细胞模型中的疾病相关RNA与蛋白质特征

《Frontiers in Neuroscience》：Disease-associated RNA and protein signatures in iPSC-derived microglia model of Alzheimer’s disease

　　

摘要 小胶质细胞作为中枢神经系统的常驻免疫细胞，在维持神经稳态及调控脑内炎症反应中发挥关键作用。现有证据表明，小胶质功能障碍参与神经退行性疾病（如阿尔茨海默病，AD）的疾病进展，但其分子机制尚未完全阐明。本研究旨在表征散发性AD患者与健康供体诱导多能干细胞（iPSC）来源小胶质细胞的疾病相关分子改变。研究人员采用整合多组学策略，对散发性AD患者与健康对照的iPSC衍生小胶质细胞进行总RNA测序、蛋白质组学及小非编码RNA（sncRNA）测序分析，并通过基因本体论（GO）分析从转录组与蛋白质组数据集中筛选失调生物学通路。此外，研究人员采用改良T4多核苷酸激酶（T4 PNK）法的小非编码RNA测序技术，绘制疾病相关sncRNA图谱并鉴定此前未表征的RNA物种。比较分析显示，iPSC衍生小胶质细胞中mRNA、蛋白质及sncRNA的表达谱均存在显著的AD相关改变。GO分析表明，细胞外通讯、胞内运输、细胞骨架组织及蛋白质-蛋白质相互作用等相关通路发生失调。进一步，改良T4 PNK-sncRNA测序方法鉴定出多个疾病相关sncRNA，包括若干潜在关联AD病理的 novel 及此前未表征的RNA物种。研究结果表明，iPSC衍生小胶质细胞是研究散发性AD分子机制的有效模型，所鉴定的转录组、蛋白质组及sncRNA改变揭示了可能参与小胶质功能障碍与神经退行性变的关键通路，其中新型疾病相关sncRNA的发现可为AD发病机制研究提供新视角，并揭示潜在治疗靶点。

《阿尔茨海默病iPSC衍生小胶质细胞模型的多组学特征解析》论文解读

阿尔茨海默病（AD）是一种进行性、不可逆且最终致命的神经退行性疾病，临床以认知下降、记忆丧失及行为与情绪改变为核心特征，病理表现为β淀粉样蛋白（Aβ）斑块沉积、神经原纤维缠结、突触与神经元丢失、脑萎缩、神经炎症等多重异常。尽管学界已对AD的遗传与环境风险因素及发病机制开展大量研究，但目前仍缺乏有效治愈手段。小胶质细胞作为中枢神经系统常驻免疫细胞，通过免疫监视、吞噬清除、突触修剪等生理过程维持脑稳态，其功能障碍已被证实可加重Aβ蓄积、驱动慢性神经炎症并促进神经退行性变，但具体分子机制尚未完全明确。由于原代人类小胶质细胞极难获取，iPSC衍生小胶质细胞成为AD发病机制研究的重要细胞模型，其中散发性AD（又称晚发型AD，LOAD）占全部AD病例的90%–95%，由遗传、环境与生活方式多因素共同作用引发，其分子特征研究更具临床转化价值。为此，研究人员以iPSC衍生小胶质细胞为模型，开展多组学分析以系统解析散发性AD的分子改变，相关研究成果发表于《Frontiers in Neuroscience》。

研究采用的核心技术方法如下：首先收集3例散发性AD患者与3例年龄、性别匹配的认知正常（CN）供体的iPSC样本，采用分阶段定向分化方案获得iPSC衍生小胶质细胞（iMG），通过免疫荧光染色验证小胶质标志物CD45与P2RY12的表达，并通过Aβ吞噬实验验证细胞功能活性；随后对iMG开展整合多组学分析，包括总RNA测序（RNA-seq）、基于T4多核苷酸激酶（T4 PNK）改良的小非编码RNA（sncRNA）测序及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）蛋白质组学分析，通过差异表达分析筛选AD相关的mRNA、sncRNA与蛋白质改变，结合基因本体论（GO）与京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析解析失调通路；同时纳入1例携带PSEN1^A246E突变的早发型家族性AD（EOAD）患者iPSC样本作为对照，比较两类AD的分子特征差异；最后通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）与蛋白质印迹（Western blot）对关键分子改变进行实验验证。

研究结果分为以下模块：

Human iPSC-derived iMG

研究人员成功建立iPSC分阶段定向分化获得iMG的流程，分化所得细胞共表达静息态小胶质标志物CD45与P2RY12，且可在体外高效吞噬荧光标记 fibrillar Aβ_1-42，证实其具备典型小胶质细胞表型与功能特征。

Sporadic AD-impacted genes

以|log₂倍数变化|>0.8且p值<0.05为阈值，共鉴定出195个散发性AD差异表达基因（DEG），其中95个下调、100个上调。GO分析显示，差异基因显著富集于细胞外囊泡（如外泌体）、染色质组装与重塑、组蛋白结合等通路，提示AD小胶质细胞的细胞外通讯与表观遗传调控发生异常。

Altered protein profile in iMG by sporadic AD

蛋白质组学分析共检测到617个表达稳定的蛋白质，其中31个为散发性AD差异表达蛋白质（DEP），包括显著上调的安定结合抑制剂（DBI）与显著下调的TSPY样蛋白2（TSPYL2）。GO与KEGG分析显示，差异蛋白质主要参与细胞外囊泡组成、辅酶A转移酶活性、磷脂转运、肌动蛋白结合及吞噬体通路，与转录组结果存在功能层面的高度一致性。

Experimental validation of RNA-Seq and proteomics data

实验验证显示，含缬氨酸蛋白（VCP）、N-乙酰神经氨酸合成酶（NANS）、α-辅肌动蛋白1（ACTN1）、尼曼匹克病C2型蛋白（NPC2）与人类白细胞抗原DRα链（HLA-DRA）的蛋白质水平改变未伴随对应mRNA的显著差异，提示上述变化发生于翻译后水平；其中HLA-DRA的蛋白表达在散发性AD iMG中显著降低，该改变具有AD特异性，且在携带APOE4等位基因的iMG中同样被观察到，但在帕金森病（PD）iMG中无此变化。

Changes in HLA-DRA expression in disease conditions

进一步验证证实，HLA-DRA表达的抑制是散发性AD与APOE4基因型共有的分子特征，而非神经退行性疾病普遍表现。

PSEN1^A246E-altered protein expression

早发型家族性AD iMG的蛋白质组分析共鉴定出47个差异表达蛋白质，均为上调。功能富集结果与散发性AD高度重叠，且两类AD共有STIP1、ACTN1与VCP 3个上调的差异蛋白质，以及AIF1、NANS与NPC2 3个表达趋势相反的差异蛋白质，提示不同亚型AD存在共享与特异的分子改变。

Altered sncRNA expression by sporadic AD

改良T4 PNK-sncRNA测序显示，tRNA衍生片段（tRF）是iMG中丰度最高的sncRNA类型，共鉴定出64个散发性AD差异表达sncRNA，包括33个上调piRNA、3个下调snoRNA、14个差异miRNA与16个上调tRF，其中tRF3与tRF5分别来源于不同的tRNA亚型，提示其可能具有不同的生物发生途径。

讨论与结论部分指出，iPSC衍生小胶质细胞可有效模拟AD的细胞内在分子改变，其多组学特征揭示了AD小胶质细胞在细胞外通讯、细胞骨架组织与代谢调控层面的广泛异常。尽管转录组与蛋白质组的重叠有限，但二者富集的通路高度一致，印证了AD的蛋白病变属性。其中HLA-DRA的下调、AIF1的功能异常及STIP1、ACTN1、VCP等分子的失调可能为AD干预提供新靶点；同时sncRNA层面的改变（尤其是piRNA与snoRNA衍生片段的异常）拓展了AD非编码RNA调控的研究视野。该研究为散发性AD的机制解析提供了高价值的细胞模型与多组学资源，所鉴定的分子特征未来有望转化为AD诊断生物标志物与治疗靶点。