《Frontiers in Neuroscience》：Progenitor diversity during formation of the mammalian neocortex
哺乳动物新皮质发育遵循精确的时空序列，最终形成负责高阶认知与行为的有序结构。越来越多的证据表明，产前发育期间神经干/祖细胞的多样化是新皮质复杂环路及功能架构涌现的关键环节。本综述将围绕正常与异常脑发育过程中细胞谱系变异的机制与后果展开讨论，重点关注自闭症谱系障碍、唐氏综合征等神经发育疾病的相关发现。
新皮质多样性的起源
新皮质环路是生物界最复杂的系统之一，源于不同细胞类型、脑区及全身系统间的精密连接。这种功能架构如何在脑发育早期被规划并执行，又如何在数百万个体中稳定复现，目前尚未完全阐明。前脑的正确模式化需要多种内在机制与外在信号共同调控；近期数据显示，胎儿脑内同时存在、但特性各异的多组前体细胞可产生特征不同的神经元，提示前体多样性在脑区发育过程中对神经元多样性的产生具有重要作用。不同前体细胞如何影响新皮质环路的复杂度与功能，是本综述的核心议题。
成熟新皮质由六层结构组成，最早出现于早期哺乳动物，甚至晚二叠纪的非哺乳合弓类中已可见类似新皮质的结构。所有哺乳动物均存在分层的新皮质结构并遵循刻板的组织规律，但物种间体积差异巨大，可表现为光滑的平滑脑（lissencephaly）或出现沟回的褶皱脑（gyrencephaly）。已有理论认为，前体细胞的活性同时支撑了皮质的整体生长与沟回化程度。值得注意的是，新皮质中多样的神经元与胶质细胞均起源于生发区中相对简单的一层神经上皮祖细胞（neuroepithelial progenitor cells, NEPs）。NEPs会快速分化出大量前体类型，这种生发区内前体分子与形态层面的快速多样化，现已被确认为正常脑发育的关键特征。
皮质前体的种类
NEPs最初通过对称分裂呈指数增长，形成发育端脑的第一层——脑室区（ventricular zone, VZ）。该指数增长阶段的持续时间在不同哺乳动物中存在差异，被认为与整体脑体积直接相关。在神经发生启动前，NEPs转化为顶端放射状胶质细胞（apical radial glial cells, aRGCs），即产前新皮质的驻留干细胞。在整个神经发生过程中，aRGCs通过不对称分裂实现自我更新，同时产生迁移至生长中皮质板的有丝分裂后神经元子代。与此同时，aRGCs也会通过不对称分裂产生至少三类形态不同的中间神经源性前体，继续在VZ及下方的脑室下区（subventricular zone, SVZ）产生神经元。这些中间前体包括顶端中间前体细胞（apical intermediate precursor cells, aIPC）与截断放射状胶质细胞（truncated radial glia, tRGC）——二者均为短双极VZ细胞类型，其突起不跨越新皮质壁；多极基底中间前体细胞（basal intermediate progenitor cells, bIPC）位于SVZ；以及栖息于外SVZ（outer SVZ, oSVZ）并可呈现多种形态的基底放射状胶质细胞（basal radial glial cells, bRGCs）。重要的是，这些中间前体及其亲本aRGCs共存于哺乳动物脑的生发区，并在整个神经发生期持续分裂，以扩增产前神经发生阶段产生的有丝分裂后神经元数量。
因此，新皮质兴奋性神经元产生的基本模块单元似乎由4种主要形态不同的细胞类型（aRGCs、aIPCs/tRGCs、bIPCs、bRGCs）构成，它们共同在产前神经发生过程中为各层产生神经元。该增殖模块及其产生的上层皮质神经元共同形成一个“径向单位”。若该模块的控制参数固定，则其在VZ内的重复复制应会产生具有相同分层特征的扩张皮层套层。事实上，多数皮质区域为同层结构，表明控制其衍生径向单位的机制在特定区域内恒定。然而，该模块的多细胞属性也赋予了其诸多可调元素，例如通过改变不对称分裂模式来偏好或抑制特定子代细胞类型，或通过信号或基因表达变化改变单个细胞类型的神经元产出。因此，调整该模块可能导致最终径向单位发生变化，而相邻皮质区域（如BA17与BA18）之间的显著分层差异，提示这些区域的潜在增殖模块可能不同。
这种模块功能的潜在可塑性可导致轻微或显著的分层后果。每个模块发育计划的暂时性变化（“blip”）也可能发生，其中部分变化可导致神经元分配及环路功能的微小但关键的改变。产前发育过程中增殖模块的异常现已与唐氏综合征、自闭症等疾病相关联，且往往不伴随上层皮质板的明显解剖学改变。未来需要对皮质模块组成进行严格验证，以充分理解发育中的微小变化如何导致持久的功能影响。这需要使用新工具识别单个神经前体细胞（neural progenitor cell, NPC）亚型，并量化其对相关上层环路的贡献。新型单细胞分子、生理和解剖方法正开始解析这些谱系差异的起源，并揭示这种发育调控下的细胞多样性爆发如何被用于构建支撑功能的离散环路。
谱系特化的机制
揭示脑前体细胞的多样性是理解哺乳动物脑发育的重要进展。不同前体群对大脑皮质形成的独特贡献，可能从根本上影响针对发育和/或衰老过程中脑改变的临川策略。背侧端脑神经元前体分子异质性的最初证据来自对胎猴VZ前体胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）表达差异的观察。此后，神经前体细胞类型间的差异基因表达已被广泛证实。例如，aRGCs与bRGCs均表达神经干细胞标志物Pax6与Sry-box 2（Sox2），二者分别对RGC的分化与自我更新至关重要。但与大多数RGC不同，bIPCs表达转录因子T-box brain protein 2（Tbr2/Eomes）。基底IPCs在位置、形态、分裂行为与基因表达上均与aRGCs存在差异。尽管Tbr2蛋白表达似乎为IPCs所特有，但近期研究发现，Tbr2转录本可由aRGCs产生，但仅在细胞分裂后的IPC子代中才被翻译成蛋白质。这种现象被称为转录预置，且在啮齿类与人类间保守。物种间的基因表达差异同样显著，例如小鼠的许多bRGCs同时表达Sox2与Tbr2，而人类大部分bRGCs并不如此。有趣的是，顶端中间前体细胞（aIPCs）与bIPCs一样进行对称性神经元生成分裂，却不表达Tbr2蛋白，而是表达Pax6并进行核内迁移（interkinetic nuclear migration, INM）及VZ内分裂。这表明并非所有中间神经前体在所有物种中都表达Tbr2，而以“对称性产出”作为功能分组标准可能更为合适。
新兴的单细胞转录组学证据表明，这些IPC类群可根据bIPCs不同簇之间的基因表达谱差异进一步细分。例如，在一些对顶端或基底前体群进行生物信息学再聚类以发现形态学类型内部差异的研究中，已鉴定出多个同时存在的独立bIPCs与aRGCs群体。然而，将这些转录亚型赋予功能性前体身份并不容易，因为转录组数据仅提供细胞群体mRNA的静态快照，处于许多关键表型决定因素（如蛋白质组、翻译后修饰、RNA修饰）的上游，而这些无法通过mRNA测序捕获。此外，尚不清楚转录变异反映的是细胞状态的暂时变化，还是真正的、持久的细胞身份或命运差异。鉴于前体亚群比例变化可诱导新皮质结构与功能的显著改变，这种对前体真实多样性的认识不足亟需解决。
皮质神经元特化受到发育过程中层产生规则的严格约束，确保在一致且时间调控的分层架构内实现高度的细胞多样化。早期关于新皮质发育的研究提供了对皮质前体控制机制的重要但有限的认知，当时认为神经上皮内的前体大多行为均一。这一观点体现在Waddington神经发生模型中，即VZ内aRGC干细胞的发育轨迹由“表观遗传景观”决定，该景观从固定的基因组位点开放与关闭的基态引导细胞命运。然而，随后的谱系追踪与异时细胞移植实验显示了皮质前体显著的命运可塑性，表明并非所有前体都具有相同的基态。例如，将早出生的皮质前体移植到更成熟的皮质中，可产生定位于浅表层皮质层的神经元；而将晚出生前体移植到更未成熟的皮质中，则不能产生与深层、早出生层相关的神经元特性，说明前体在神经发生过程中经历命运可塑性的渐进限制。这些观察后来通过FlashTag脉冲标记技术对aRGC库的等时命运图谱得到确认与扩展，结果显示存在时间上的递进以及转录基态的动态更替，这与先前的Waddington模型形成对比。新的命运特化范式还引入了随机细胞命运决定的可能性，可调节具有特定功能属性的神经元总体产出。同时也需认识到系统具备代偿性可塑性，即内在与外在机制可在细胞仍处于生发区时，或在神经元迁移期间及之后，“纠正”神经发生过程的不良扰动。皮质形成也受外部信号影响，例如对细胞外基质成分的响应、差异性的感觉输入（如新皮质第4层锥体神经元需要丘脑传入信号的成熟调控），或与胶质细胞和抑制性神经元的相互作用。因此，区分神经元特性的内在与外在驱动因素至关重要但也十分困难，因为这两类信号通常在空间与时间上重叠。
活体成像与超分辨率显微镜的进步允许追踪不同有丝分裂方式后的细胞命运，有望填补这些认知空白。一种名为时间复用成像的新方法，利用不同光转换荧光蛋白的可变动力学实现对多种细胞内靶标的多重活体成像。借助这些新技术，一种可行策略是对不同前体类别的有丝分裂行为进行遗传标记与长期追踪，以获得其在新皮质发育过程中作用的高分辨率动态信息。
祖细胞异质性：演化视角下的皮质扩张
多条证据表明，高等哺乳动物以独特方式利用不同的皮质前体细胞类群来增加表面积与计算能力。以灵长类为例，人类新皮质体积约为黑猩猩的3倍，神经元数量为2倍。人类新皮质惊人的扩张（据估计是小鼠的1000倍）关键原因之一，是VZ内前体细胞总数增加以及通过基底前体实现的间接神经发生显著增强（如oSVZ内bRGCs数量更多）。这种通过增加单个前体类群数量实现的皮质扩张，可能会提升神经信息处理能力，尤其是当这一过程产生了具有独特膜与电生理特性的额外神经元时。
皮质神经元分配的一般特征最早在非人灵长类发育实验中发现，新皮质分层结构以“由内向外”的方式发育：早出生神经元形成深层，晚出生神经元迁移越过旧神经元建立浅层。然而，与灵长类脑皮质层极为精确的时间特化不同，近期一项小鼠研究显示，同期出生的神经元最终可占据新皮质的不同层，这一模式更符合其未来的轴突投射亚型，而非出生日期。这些新结果表明，至少在啮齿类中，内在潜能可能是神经元位置的仲裁者，而非出生日期。这一明显差异有待未来研究阐明，以确定预设的皮质分层与连接模式是否具有物种特异性，或由不同前体谱系以不同方式编码。
多样的祖细胞特征也可能是决定光滑脑或褶皱脑形成的关键因素。事实上，前体增殖与皮质扩张被认为与皮质沟回程度直接相关。例如，褶皱脑非人灵长类的新皮质发育经历延长的神经发生期，并通过延长妊娠期以允许最大次数的分裂。目前提出了多种假说解释差异神经发生如何支撑皮质沟回化，包括径向扩张、差异切向扩张与轴突张力假说。径向扩张认为，浅表锥体神经元的选择性过度产生相对于深层细胞，可导致浅表层的局部增宽并形成脑回；切向/侧向扩张指不同新皮质区域以不同速率进行切向扩散，最终形成脑回与脑沟；轴突张力假说则认为，轴突树突及其差异延伸驱动区域性新皮质折叠，即皮质-皮质轴突纤维的局部延伸增加可产生局灶性机械张力，诱导新皮质表面折叠与沟回化。这些模型本质上都依赖差异神经发生来建立组织扩张或神经元连接的区域特异性模式，进而产生新皮质折叠所需的多样机械力。最终，每种沟回化模型都指向由特定前体类群驱动的独特神经发生通路，其时空动态塑造了发育中新皮质的扩张与折叠模式。
对褶皱脑物种的研究已开始揭示前体谱系对皮质折叠与新脑回形成的特异性贡献。例如，家养雪貂的所有沟回均在出生后出现，其oSVZ相比光滑脑啮齿类显著扩张。表达Homeodomain-Only Protein Homeobox（HOPX）的bRGCs被证明对雪貂正确的皮质折叠至关重要，且证据显示未来脑回与脑沟下方的oSVZ具有独特且特异的转录特征。除HOPX外，未来脑回区域Tbr2表达的升高与更大的bIPC和bRGC池相关；相应地，抑制Tbr2会减少这些前体群并破坏上层扩张，阻止正常的脑回与脑沟形成。这些发现支持沟回化位点的预设由卷积位点下方的生发区细胞决定。人类与小鼠前体亚群的转录组学研究进一步支持了基底前体谱系在皮质沟回化中的重要性，其中人类基因ARHGAP11B被发现可在放射状胶质中促进IPC身份。在小鼠、雪貂与狨猴发育皮质中表达ARHGAP11B，均可引起bRGC自我更新增强、沟回化增加及新皮质扩大，强烈支持其在皮质卷积中的因果作用。
其他研究也将bIPC与bRGC活性与沟回化联系起来。例如，通过Sonic Hedgehog（SHH）通路的组成型激活信号增强其增殖，足以在小鼠扣带皮质诱导异位脑回样突起，且这些突变体中aRGC增殖未受影响，强烈提示基底前体扩张是小鼠局部皮质扩张的关键驱动因素。另一项小鼠研究发现，调控皮质前体中Trnp1基因的水平，足以使其行为偏向自我更新/切向扩张或bIPC分化/径向扩张，为沟回化如何启动提供了基础。然而，虽然小鼠新皮质的这些突起可能指示预设皮质脑回的基础如何形成，完整且正常的沟回化可能还依赖光滑脑小鼠所缺乏的其他机制。比较研究显示，从aRGC到bIPC分化的总体时间顺序在人类、非人灵长类与啮齿类皮质发生模型中高度保守，但猕猴与啮齿类在bRGC生成与分化过程的转录组层面存在显著差异，这很可能是由于啮齿类皮质中指定的bRGC更少。这种特定前体类型的多样化在人类与猕猴中均被延长，凸显了bRGC在组织褶皱皮质中的突出作用。
尽管雪貂与啮齿类模型为特定信号通路如何影响前体行为及随之而来的皮质扩张提供了宝贵见解，但这些模型也突出了限制我们全面捕捉新皮质沟回化演化复杂性的物种特异性局限。确定性研究需要能够开展分子、成像与纵向活体研究的褶皱脑物种。此外，利用诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）等体外模型及来自褶皱脑物种的外植体制备（如器官型切片培养）的比较方法，将提升前体异质性发现的严谨性与转化相关性。
除作为大多数上颗粒层/浅层锥体神经元的起源部位外，褶皱脑中的oSVZ还可能是截断放射状胶质细胞（tRGCs）细胞突起的终止点，这类细胞不接触软脑膜表面，且与基于oSVZ的bRGCs纤维不连续。在雪貂中，这些截断前体最终分化为衬于脑室空间的星形胶质细胞与室管膜细胞。褶皱脑中的tRGCs在形态上与小鼠中的顶端中间前体细胞（aIPCs）相似，二者是否存在功能、转录组或谱系上的相似性尚不清楚。一种可能是，tRGCs与aIPCs均在aRGC生成bRGC时形成——它们可能是留下并保留脑室足突的子代细胞，而另一个子代（bRGC）继承了上升突起并移入oSVZ；另一种可能是，tRGCs是已收回软膜接触足突或因外部因素导致其长突起发生创伤性断裂的aRGCs。无论这些短前体类型如何形成，tRGCs与aIPCs是否在脑发育中共享分子身份与功能角色尚未确定。解析tRGCs的起源、作用及演化保守性，是未来重要的研究方向，将有助于揭示它们是否以及如何结构性地参与新皮质发育。
祖细胞异质性：对皮质环路的影响
祖细胞多样性的另一特定作用，可能是传递成熟皮质所需的各种内在状态与轴突靶向模式。出生标记、克隆追踪与遗传命运图谱研究显示，同一皮质层中但源自不同前体谱系的神经元，具有独特的电生理与形态特征。例如，源自Tbr2表达IPC谱系的锥体神经元（通过间接神经发生产生）相比直接由aRGCs产生的神经元，表现出更高的输入电阻，并对去极化电流产生更高频率的动作电位；同时，Tbr2谱系神经元的树突复杂性较低，尤其是顶树突树。尽管每层皮质可能由不同谱系的神经元组成，但同一aRGC的克隆子代可分散至多层，这提供了在新皮质壁中水平与垂直双向产生多样性的演化策略。由于胎儿新皮质中神经元具有特定的功能特征与多样的定居行为，不同前体谱系的混合可能是驱动新皮质结构与功能连接多样性的引擎。更大、更复杂的人类胚胎新皮质，要么源于所有哺乳动物共有相同数量前体类型的增强产出，要么是因为人脑拥有比小型光滑脑物种更多样的独特前体类群。考虑到将生物信息学生成的细胞簇解读为独立类型而非细胞状态的谨慎性，现有证据支持这两种机制并存：人类胚胎新皮质中生物信息学鉴定的前体亚型/状态总数高于小鼠，最高估计在受孕后第3–12周的人类新皮质中共有24个放射状胶质细胞簇。人类脑中增加的前体多样性很可能意味着生发区存在更复杂的细胞类型特异性调控，并提示其他褶皱脑物种也可能具有更多的前体细胞类型或状态。
近期研究已开始确认不同皮质前体谱系的分层贡献。例如，一项采用多种Cre-lox与Flp/FRT转基因小鼠品系的交集标记策略，对通过直接（经由aRGC）与间接（经由IPC）神经发生途径出生的锥体神经元进行了命运图谱。结果显示，aRGCs对所有主要锥体神经元类群均有贡献，但对深层（V/VI层）神经元的产生最为显著；而间接途径则贡献了绝大多数浅层（II/III层）锥体神经元。因此，直接与间接神经发生途径对锥体神经元中各类投射亚型贡献不同，包括主要起源于间接神经发生的局部投射端脑内（intratelencephalic, IT）锥体细胞、混合起源的向皮质下投射的锥体束（pyramidal tract, PT）神经元，以及专门靶向丘脑的皮质丘脑（corticothalamic, CT）神经元（主要起源于直接神经发生）。多条证据现已表明，不同前体谱系产生的神经元具有独特的膜特性及皮内/外连接模式。这种产生兴奋性与连接性变异的潜力，为支持复杂环路特性提供了框架。
神经发育障碍中的谱系特异性
前文讨论的皮质神经元谱系与命运分配的关联，需要对多个前体群进行严格控制，包括它们在空间中的物理坐标、其子代出生与迁移的时间控制，以及分子特征向下代细胞的传递。即使单一前体池的发育序列发生改变，也可能导致皮质形成的显著变化。与此一致，携带TBR2纯合突变、导致bIPC池耗竭的人类会出现小头畸形与白质缺陷。产前发育的异常可能也是多种神经发育障碍的标志，包括染色体异常（如21三体/唐氏综合征，Down syndrome, DS）与自闭症谱系障碍（autism spectrum disorders, ASDs）。越来越明确的是，图1A所示的增殖模块的发育异常可能直接影响患者终生环路层面的改变。例如，来自17–21孕周的DS胎儿组织显示，在海马齿状回及侧脑室和第三脑室生发区中，NPC增殖减少，且早于脑体积变化的出现。这种神经发生的减少可能导致NPC池耗竭，且在孕中期（18–24周）DS发育中皮质的oSVZ中SOX2阳性前体数量减少。这些NPC增殖与存活的改变与发育过程中多个脑结构的细胞减少相关，包括19孕周时前脑显著的细胞丢失。其他区域（如颞上回新皮质）的细胞密度降低则仅在23孕周后观察到，提示DS个体的神经发生缺陷具有区域与时间特异性驱动因素。总体而言，这些数据表明皮质片层中的增殖模块可能在不同区域与不同时间发生异常。
动物模型研究证明，皮质前体对与DS等神经发育障碍相关的转录机制改变与基因剂量改变高度敏感。例如，DS中的额外21号染色体通过延长细胞周期与增加新皮质NPC凋亡来影响胎儿脑发育，导致小头畸形与皮质分层异常。重要的是，正如Ts65Dn小鼠所示，该过程还包括bIPC增殖的暂时性增加，这可能代表了对神经元产量不足的代偿反应。动物模型强化了这些发现：Ts65Dn小鼠表现出aRGC细胞周期延长与前体产出减少，而人源化TcMAC21模型则显示出孕中期bIPCs的短暂缺陷，导致皮质分层与活动的长期损伤。这些结果揭示了不同前体类群对21三体的特异性敏感性，并提示即使在神经发生关键窗口期的暂时性干扰，也可对新皮质结构与功能产生持久影响。
前体细胞改变的风险似乎也适用于自闭症谱系障碍（ASD）。多种遗传与环境ASD动物模型均揭示了特定前体群的紊乱，通常涉及ERK/MAPK与mTOR等信号通路异常。例如，在16p11.2缺失模型中，过度活跃的MAPK信号增强了前体增殖但加速了细胞周期退出，导致前体池耗竭并引发投射神经元亚型失衡。失调的mTOR信号特异性改变了bRGC的形态与分裂，但不影响增殖，强调了oSVZ前体可能具有独特的易感性。环境模型（包括母体免疫激活与丙戊酸暴露）同样影响bRGCs与浅层神经元的生成或功能。
综合来看，这些发现提示，前体亚型（特别是bRGCs与bIPCs）的独特但汇聚性紊乱，可能是DS与ASD核心特征的潜在基础。鉴于这些前体在产生上层兴奋性神经元中的关键作用，其调控异常可能合理导致兴奋/抑制平衡的异常，这是ASD与DS共有的特征。解析这些疾病中共同的发育时间窗与前体特异性易感性，可能有助于确定有效的治疗窗口与策略。
结语与未来展望
我们对新皮质发育与环路的传统理解往往强调外部驱动过程，而忽视了生发区内微小、内在编码（遗传、表观遗传和/或细胞层面）的自组织原则可能发挥的重要作用。然而，将前体生物学的深入认知纳入脑功能的概念框架，既与保守的演化压力一致
