《Frontiers in Behavioral Neuroscience》：IntelliCage protocols using incentive-disincentive dual motivation work with male as well as female mice and reveal sex differences in motivated behavior
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摘要：引言：在 IntelliCage 系统中，可在社会性家笼情境下并在无人类实验人员抓取干预的条件下，对小鼠的自发行为和认知能力进行自动化评估。研究人员近期已证明，采用经优化且不包含限水的 IntelliCage 实验方案，可以促使雌性小鼠学习复杂空间任务，
摘要：引言：在 IntelliCage 系统中，可在社会性家笼情境下并在无人类实验人员抓取干预的条件下，对小鼠的自发行为和认知能力进行自动化评估。研究人员近期已证明，采用经优化且不包含限水的 IntelliCage 实验方案，可以促使雌性小鼠学习复杂空间任务，从而消除学习能力较差个体发生水剥夺的风险。该类方案通过结合激励性（incentive）与去激励性（disincentive）味觉刺激，构建双重动机。小鼠学习获取糖精（saccharin）甜化饮水，而以奎宁（quinine）致苦的饮水则持续可得。
方法：本研究共使用 64 只 C57BL/6J 小鼠，比较雄性与雌性小鼠在双重动机实验方案下的表现，并与仅使用糖精作为激励刺激的单一动机实验方案进行对照评估。
结果：研究发现，在双重动机实验方案中，只要目标角位置随时间保持稳定，雄性小鼠的学习表现至少可与雌性相当。当目标位置频繁改变，且这种改变取决于动物自身选择时，雄性小鼠的动机下降，学习表现较差。基于舔舐次数（lick counts）分析，未发现加入去激励刺激后液体摄入受损的证据。
讨论：本研究表明，采用双重动机实验方案，可以为 IntelliCage 构建无需通过限水强制学习、且适用于两性小鼠学习的空间学习任务。此外，研究结果揭示了一种在限水强化学习实验方案中并不明显的动机性行为性别差异。研究人员提出假设认为，这种性别差异可能与 IntelliCage 中雄性小鼠群体的社会—空间组织有关。
本文发表于《Frontiers in Behavioral Neuroscience》，围绕 IntelliCage 系统中动物福利优化、学习动机维持及性别差异识别等关键问题展开。研究背景在于，传统行为学测试常依赖抓取操作、短时测试和限水等强化手段，既可能增加应激、影响重复性，也与动物实验 3R 原则存在张力。IntelliCage 作为一种可在社会性家笼环境中连续、自动化监测行为的平台，能够减少人为干预并提高生态学效度，但其既有多数学习范式通常通过限制错误反应后的饮水获取，甚至缩短饮水时窗，来维持较强学习驱动。虽然这种设计可促进困难任务的学习，却会使学习较差个体面临脱水风险，并可能导致提前剔除动物、降低统计效能。此前研究提示，在完全避免限水、仅以糖精甜水作为奖励时，雌性小鼠对复杂海马依赖性空间任务的学习动机不足，雄性小鼠在任务挑战出现后动机下降更快。因此，本研究的核心问题是：是否可以通过“激励性刺激 + 去激励性刺激”构成的双重动机，在不恢复限水成分的前提下，同时维持雄、雌小鼠对复杂 IntelliCage 空间任务的参与和学习。
研究人员据此建立并系统评估了一套双重动机 IntelliCage 方案。该方案中，任务侧（task side）提供 0.5% 糖精钠溶液作为奖励性液体，joker 侧持续提供 0.3 mM 奎宁溶液作为去激励性液体；对照组则在 joker 侧提供普通水，构成单一动机方案。结果显示，双重动机显著增强了两性小鼠对任务侧反应的偏好，并总体改善了学习表现。尤为重要的是，在目标角位置稳定、主要依赖参考记忆（reference memory）的任务中，雄性小鼠在双重动机条件下的表现不弱于雌性，甚至在部分阶段略优；但在目标频繁变动且依赖动物近期选择、需要灵活 win-shift 策略和工作记忆（working memory）的任务中，雄性小鼠的动机优势突然消失，学习显著变差。与此同时，基于舔舐次数和体重变化，研究未发现奎宁暴露造成明显液体摄入不足、健康受损或体重增长受抑。由此可见，该研究不仅证明双重动机方案可在更符合 3R 原则的前提下支持两性小鼠完成 IntelliCage 空间学习，也揭示了限水强迫学习范式中不易显现的动机性行为性别差异。
在技术方法上，研究以苏黎世大学解剖学研究所饲养并实验的 C57BL/6J 小鼠为样本来源，采用 RFID（射频识别）转ponder 标记与 IntelliCage 全自动行为记录系统，对群居状态下小鼠的访问（visit）、鼻触（nose poke）和舔舐（lick）行为进行连续监测。实验设置包括适应阶段、多个渐进加难的空间学习任务及恢复阶段；通过任务反应比（response task ratio）、饮水任务比（drinking task ratio）、错误率（false rate）和每日舔舐次数评价动机、偏好、学习与液体摄入。统计学上使用线性模型分析组别、性别及阶段/时间效应，并采用 Box-Cox 变换、Benjamini-Hochberg 法控制多重比较的假阳性率。
研究结果
Introduction of quinine during the adaptation phase had a stronger effect on the motivation to respond at task sides in male mice
在最初适应阶段，小鼠先经历自由适应（FA），随后进入分三步实施的鼻触适应（NPA I–III）。FA 期间所有门开放且均提供普通水，小鼠总体如预期逐步适应新环境。进入 NPA 后，joker 侧在每次到访角落时自动开门 3 s，task 侧则需鼻触才能开门。双重动机组在 NPA II 首次接触奎宁，所有实验组在 NPA III 接触糖精。结果表明，奎宁引入后，双重动机组迅速形成对 task 侧反应的明确偏好，而且这种效应在雄性中强于雌性；加入糖精后，双重动机组进一步增强 task 侧反应偏好，对照组也建立了偏好，但强度和稳定性均不及双重动机组。饮水偏好与反应偏好总体一致，到适应末期所有组均表现出对 task 侧饮水的清晰偏好。该部分说明，在无学习挑战时，去激励刺激奎宁对雄性促进任务侧反应动机的作用甚至强于雌性，而单纯糖精激励在两性中的作用相近。
The dual motivation protocol improved motivation and learning in all but the last task in females but became ineffective during the diagonal sequencing and chaining tasks in males
在学习阶段，研究依次设置地点偏好获得（place preference acquisition, PPA）、地点偏好逆转（PPR）、连续逆转（serial reversal, SR）、地点—时间获得（place time acquisition, PTA）、地点—时间逆转（PTR）、对角序列获得（diagonal sequencing acquisition, DSA）、对角序列逆转（DSR）、链式获得（chaining acquisition, CA）和链式逆转（CR）等任务，难度逐步增加。
在 PPA 中，仅一个固定正确角的 task 侧可经鼻触获得糖精。研究发现，对照组雄性学习和表现劣于对照组雌性，而双重动机组维持了稳定的 task 侧反应偏好并整体表现更好。在 PPR 中，正确角对角转移，双重动机组再次优于对照组，但未见性别差异。在 SR 中，正确角每 24 h 按伪随机模式变化，双重动机组继续显示更优学习与表现，而对照组倾向转向 joker 侧反应。
在 PTA 中，正确角随昼夜时间在相邻两角之间切换，双重动机组明显优于对照组，且双重动机组雄性学习速度略快于同组雌性；PTR 中这一优势仍然存在，并且控制组雄性进一步转向偏好 joker 侧反应。至此可见，在目标角位置可维持 12 h 至数日且不受动物即时选择影响的任务中，双重动机足以补偿雄性在单一动机方案中的不利地位。
然而，在 DSA 中，正确角会在每次正确 task 反应后对角切换；在 DSR 中，先前错误的两角变为符合该规则的正确角。此时，虽然双重动机组整体仍优于对照组，但雌性显著优于雄性，且仅双重动机组雌性能持续维持对 task 侧的偏好，雄性则迅速接近无偏好状态。进入 CA 后，正确角按顺时针或逆时针序列在每次 task 反应后切换，只有双重动机组雌性仍表现出更好的学习和更稳定的 task 侧偏好，雄性已不再从双重动机中获益；在最困难的 CR 中，各组表现均较差，组别和性别差异均不再显著。该结果表明，双重动机对雌性的促进作用几乎贯穿整个任务序列，唯在最终最困难任务中失效；对雄性而言，这种促进作用在目标稳定任务中显著，但在高频切换目标、依赖灵活策略更新的任务中明显崩解。
Quinine stabilized and equalized the motivation of male and female mice to respond at task sides during recovery phases
为避免不同学习规则间相互干扰，研究在各学习任务间插入恢复阶段，并重复 NPA III 类似方案。结果显示，在恢复期内，双重动机组对 task 侧反应的偏好始终高于对照组，且这种效应在雄性中更明显。对照组雄性的 task 侧偏好不仅波动更大，而且随实验进展逐渐下降，到末期接近无偏好。双重动机组大多数动物几乎一直维持对 task 侧饮水的强烈偏好。该结果说明，奎宁作为去激励刺激不仅能提高任务期动机，也能在非学习恢复期稳定 task 侧取向，尤其对雄性具有明显“校正”作用。
There was no evidence for a restriction of drinking or weight gain by the exposure to taste stimuli and learning challenges
关于福利与摄入安全性，研究连续监测每日舔舐次数，并定期记录体重。适应阶段中，舔舐次数在两组中均下降，雄性下降更明显；学习与恢复阶段中，舔舐次数进一步下降，但未见一致的组别效应。始终维持自由适应方案的 neutral 福利对照组，其舔舐次数范围与实验组相近，性别差异和时间变化模式也大致一致。体重方面，所有组别均随时间稳定增长，双重动机组与单一动机组之间无不利差异。以上结果共同表明，无论是学习挑战本身，还是奎宁这一去激励刺激的加入，都未导致明显的饮水受限或体重增长受损。
讨论部分总结
讨论部分首先确认了本研究的主要发现：双重动机方案能够在不依赖限水强制学习的情况下，显著提升 IntelliCage 空间任务中的任务参与度和学习表现，并使雄、雌小鼠都能完成一系列海马依赖性任务。与既往观察一致，在单一动机条件下，雄性在面对学习挑战时比雌性更难维持为糖精而工作的动机，这种动机不足与某些任务中较差表现相伴随。加入奎宁后，雄性在适应、学习和恢复阶段都表现出更强的为糖精进行 task 侧反应的倾向，说明去激励刺激对其动机提升作用十分显著。尤其在目标位置稳定的任务中，双重动机消除了对照组雄性的动机劣势。
讨论中进一步指出，雄性双重动机组在从 PTR 过渡到 DSA 时出现的动机和表现骤降，并不符合“任务整体难度逐渐增加”这一单一解释。因为这一崩解点恰恰对应任务规则性质的改变：前一类任务中奖励目标稳定、不依赖近期选择，偏向 win-stay 策略和参考记忆；后一类任务中奖励目标频繁变化且受动物选择影响，偏向 win-shift 策略并更依赖工作记忆。作者据此认为，问题更可能出在动机而非认知容量本身。由于既往在采用限水强化学习的 IntelliCage、8 臂放射迷宫和 T 迷宫等工作记忆任务中，雄性并未稳定地比雌性差，因此“雄性工作记忆更弱”并非有力解释。
在机制层面，论文谨慎讨论了社会—空间组织的可能作用。由于雄性小鼠的气味信号、社会等级和领地相关行为在群居环境中具有重要作用，而 IntelliCage 正是在社会性家笼中进行空间学习，研究人员提出一种假设：当学习规则要求动物频繁放弃刚刚有效的位置并根据近期行为不断转换目标角时，这种灵活 win-shift 需求可能与雄性群体中由社会层级或空间占据驱动的角落偏好发生冲突；相反，目标长时间稳定的任务可能允许群体逐渐将社会—空间组织适配到奖励布局之中。作者同时明确指出，这只是基于现有结果提出的假设，尚需通过平行比较群养与单养雄鼠等后续实验加以验证。
此外，讨论也评估了其他可能因素。研究认为，过度雄性间攻击不太可能是主要解释，因为实验巡视中未见明显攻击增多，也未在健康检查中发现咬伤或异常体重变化。IntelliCage 的丰富化环境及避免完全清除气味标记的清洁流程，可能有助于降低攻击并维持社会耐受。论文也坦陈若干局限：未监测雌性动情周期；液体摄入只能以舔舐次数作为替代指标，无法直接测量体积；研究仅限于一种近交系、特定年龄、单一实验室环境和特定任务类别；性别与组别因技术原因嵌套于笼位之内，尽管作者通过笼间散点分布尽量排查了笼效应，仍需独立重复验证。
研究结论部分翻译
总之，本研究表明，采用基于激励性与去激励性味觉刺激相结合的双重动机实验方案，可以为 IntelliCage 构建一组更好落实 3R 原则的空间学习任务，即无需通过限水来强制学习，同时又能满足让两种性别小鼠都能够学习的要求。研究未发现以奎宁作为去激励刺激会对健康、体重或作为液体摄入估计指标的舔舐次数造成明显不良影响。此外，研究观察到雄性小鼠在目标频繁变化的学习任务中参与动机远低于雌性，这揭示出一种在采用限水强制学习的实验方案中并不明显的动机性行为性别差异。
