《npj Dementia》：Early onset rapidly progressive frontotemporal dementia due to a novel MAPT P301A variant with functional validation of pathogenicity
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额颞叶痴呆（Frontotemporal dementia, FTD）是一组以进行性行为或语言改变为特征的临床综合征，与额颞叶萎缩相关。约40%的FTD病例具有家族性，其中MAPT（微管相关蛋白tau）基因突变是主要的家族性形式。在MAPT变异体中，密码子30
额颞叶痴呆（Frontotemporal dementia, FTD）是一组以进行性行为或语言改变为特征的临床综合征，与额颞叶萎缩相关。约40%的FTD病例具有家族性，其中MAPT（微管相关蛋白tau）基因突变是主要的家族性形式。在MAPT变异体中，密码子301的置换——特别是P301L、P301S和P301T——是公认的常染色体显性遗传额颞叶变性（frontotemporal lobar degeneration, FTLD）的致病原因。相比之下，据我们所知，P301A置换尚未在患者中报道。本研究描述了一种新型P301A MAPT变异体，其表现为早发、快速进展的FTLD。研究人员利用生化和细胞实验表明，P301A tau比野生型（wild-type, WT）和P301L tau纤维化更快、播种能力更强，其表现与P301S相当。这些发现表明P301A变异体具有致病性。这项工作扩展了FTLD-MAPT的变异体谱系，并支持了一个模型，即P301位点的不同置换对tau聚集和朊病毒样传播产生差异化影响。
额颞叶痴呆（FTD）是一组异质性综合征，通常表现为进行性的行为或语言变化，并伴有额叶或颞叶萎缩。FTD是早发性痴呆的常见病因，具有高度遗传性，约40%的患者有家族史，其中MAPT、GRN（颗粒蛋白前体）和C9orf72基因的致病变异导致了大多数单基因病例。特别是，MAPT变异体直接将tau功能障碍与疾病发病机制联系起来。致病性MAPT变异体包括错义、同义或缺失突变，发生于外显子或内含子中。密码子301（P301）的错义替换，尤其是P301L和P301S，是明确的常染色体显性遗传FTD的致病原因，并被广泛用于临床前模型。本研究报道了一例此前未描述的MAPT替换P301A，该变异出现在一名患有早发、快速进展性FTD的患者中，并进行了比较野生型tau与P301A、P301L和P301S的互补生化和细胞研究。研究发现P301A相对于野生型和已确定的P301变异体加速了tau聚集并增强了播种活性。这些数据扩展了FTLD-MAPT的遗传谱系，并突出了P301作为一个生物物理敏感位点，其不同置换可差异性调节tau的致病性。
在临床评估方面，研究人员在加州大学旧金山分校记忆与衰老中心进行。参与者在关于FTD的研究项目中提供了书面知情同意书。全外显子组测序在UCSF基因组医学实验室进行。MRI扫描在3T扫描仪上获得。全外显子组测序采用Twist Bioscience人类综合外显子组和线粒体Panel对提取的基因组DNA中的外显子区域进行靶向捕获。使用Illumina测序系统进行100 bp双端测序。得到的DNA序列与已发布的人类基因组（UCSC hg38参考序列）进行比对和分析。单核苷酸变异体使用Moon（Invitae Corporation）进行过滤、排序和注释。所有报告的变异体均通过长距离PCR和测序的组合得到确认。平均覆盖深度为149×，质量阈值为99.57%（≥25×）。长读长基因组测序按照先前描述进行。简而言之，使用PacBio HiFi（CCS）化学在Revio仪器（Pacific Biosciences）上对来自先证者的高分子量基因组DNA进行测序。使用SMRTbell Template Prep Kit 3.0制备SMRTbell文库，经AMPure磁珠大小选择后，在两个Revio SMRT细胞上进行测序。生成CCS读长并比对至GRCh38 no-alt参考基因组。使用DeepVariant v1.8.0进行SNV和indel检测，并使用WhatsHap v2.4进行定相。使用pbsv v2.10.0鉴定结构变异。变异调用使用结合了gnomAD人群频率和标准临床变异解释资源的内部流程进行注释。重复扩展评估在一组经过整理的疾病相关串联重复位点中进行。重组人全长2N4R tau蛋白在E. coli BL21-CodonPlus细胞中表达和纯化。使用SDS-PAGE确认了所有四种蛋白（WT、P301A、P301L、P301S）的高纯度制备。动力学硫磺素T（Thioflavin T, ThT）实验和负染色透射电子显微镜用于表征蛋白纤维化。Tau播种活性使用HEK293T tau FRET生物传感器细胞和人iNeuron FRET生物传感器细胞进行评估，并通过活细胞成像和FRET流式细胞术进行分析。
临床病例描述：先证者为一名21岁的华裔南方女性，神经发育正常，惯用右手，直到症状出现前学习成绩和运动表现一直优秀。她因头痛、轻度记忆症状和理解书面文字困难就诊于学生健康诊所，此前数天头部曾被篮球击中。无意识丧失，初步诊断为脑震荡。症状出现3个月后的脑部MRI回顾性复查显示轻度不对称性颞叶体积减少，杏仁核和海马前部体积相对较低。至症状出现4个月时，她失去了功能性独立，在熟悉的区域导航困难，需要协助管理预约。她逐渐出现理解书面和口头语言困难、焦虑、失眠、注意力集中障碍和易怒。在症状出现约6个月时，由外部医院神经科医生评估，表现为明显分心。在11个月时，出现精神病恶化、听觉幻觉、严重淡漠、社交互惠有限、接受性语言严重丧失，语言仅限于模仿言语或持续性短语。在14个月时，转入加州大学旧金山分校进行评估，脑MRI显示进行性严重萎缩，左侧重于右侧，最显著于杏仁核、海马、岛叶皮层、颞叶前部、背侧额上回和背侧顶叶。脑电图显示轻度电压不对称。实验室和遗传检测排除了朊病毒病、自身免疫性脑炎、代谢性疾病等。在加州大学旧金山分校基因组医学实验室进行的遗传检测，包括全外显子组测序、拷贝数变异分析和线粒体基因组测序，揭示了一个可能致病的杂合MAPT错义变异：NC_000017.11:g.46010388C>G; NM_005910.6:c.901C>G; NP_005901.2:p.Pro301Ala。全外显子组测序和长读长测序证实了MAPT c.901C>G (p.Pro301Ala)变异的存在，并未发现任何其他与表型相关的单核苷酸变异、重复扩展、结构变异或意义未明的变异。MAPT单倍型被确定为H1m。根据行为和语言功能的进行性衰退、符合行为变异型FTD和原发性进行性失语的诊断特征，以及MAPT变异和额颞叶萎缩的MRI模式，做出了FTD的临床诊断。
生化与细胞分析：为评估P301A替换的致病潜力，研究人员表达并纯化了四种全长2N4R tau蛋白：WT、P301A、P301L和P301S。SDS-PAGE证实了所有四种蛋白的高纯度制备。动力学硫磺素T（ThT）实验显示，P301A和P301S tau表现出几乎重叠的聚集动力学，两者相对于WT均显著加速，而P301L聚集较慢但仍快于WT。对聚集半定量的分析证实，与WT相比，P301A、P301S和P301L的滞后期显著缩短。负染色透射电子显微镜证实，所有四种蛋白（包括P301A）均形成了具有丰富成熟纤维形态的纤维结构。这些发现确立了P301A tau能进行快速、稳健的纤维化，与其他致病性P301替换相当。为直接评估P301A tau的致病播种能力，研究人员首先使用HEK293T tau FRET生物传感器细胞进行活细胞成像。与野生型纤维相比，P301A纤维产生了更早发生和可见更快的tau包涵体积累。通过FRET流式细胞术比较了WT、P301L、P301S和P301A tau形成的纤维的播种效率。剂量反应曲线显示，与WT相比，所有P301变异体的播种活性均显著增强。以“相对WT的倍数变化”表示播种活性，结果显示P301A > P301S > P301L（分别约为WT的72倍、61倍和45倍），且P301A的播种效力显著高于P301S和P301L。为在更生理相关的神经元环境中评估播种能力，研究人员将tau纤维（10 nM）应用于人iNeuron FRET生物传感器。所有三种P301变异体——P301A、P301S和P301L——均能稳健地诱导神经元内tau包涵体，而WT纤维产生的聚集较少。这些发现证实P301A tau能在神经元中高效播种tau病理。
研究结果显示，MAPT P301A是一种新型致病性变异体。在临床层面，携带该变异的先证者表现为极早发（21岁）、快速进展的FTD和显著的额颞叶萎缩，其发病年龄和疾病进程远超出MAPT-FTLD典型的40-50岁发病范围。在遗传学层面，全外显子组和长读长测序仅鉴定出一个罕见的MAPT变异，没有其他替代性遗传驱动因素。在机制层面，纯化的P301A tau在体外表现出加速的纤维化，并在细胞生物传感器实验中表现出稳健的播种能力，这与患者快速的临床进展相一致。这些临床、影像学和机制数据共同支持该变异在已知热点位点产生了一个致病性的功能获得，并扩展了超出P301L/S/T的致病性替换谱系。研究还推测，P301位点的替换可能通过破坏局部β-发夹结构（保护VQIVYK聚集核心基序）来降低纤维化屏障，从而增强致病性。P301A突变导致脯氨酸变为丙氨酸，失去了刚性的吡咯烷环，增加了局部骨架柔性，预计会削弱这种保护性发夹。
研究的讨论部分指出，这是首例与MAPT P301A替换相关的FTD综合征报告。该变异可能通过破坏局部结构而增强tau聚集和朊病毒样传播，导致特别早发或快速进展的疾病表型。虽然仅基于单个病例的推断需要谨慎，但早期发病、快速病程以及生物物理一致性的结合表明P301A应被视为致病性变异，并应纳入对早发、快速进展性FTD的评估。该变异在双侧家系中均无年轻发病性痴呆病史，且父母均无认知障碍报告，结合测序结果，提示该变异可能为新生突变。一项大型国际研究表明，遗传性FTD的发病年龄和疾病持续时间受特定MAPT突变的影响很大。与P301L和P301S突变携带者相比，本病例的发病年龄更小、病程更快，表明密码子301的替换可导致广泛的疾病严重程度谱系，而P301A可能代表该连续体中的一个极端。同时，不能排除环境修饰因素对异常早发和快速表现的贡献。患者的症状出现在轻度头部损伤后，而创伤性脑损伤与表达P301S tau的实验模型中加速的tau病理和认知衰退相关。鉴于其快速的临床进程，该P301A病例符合快速进展性痴呆的标准。
结论部分指出，P301A是MAPT基因中一个新型的致病性变异体，可导致早发、快速进展性额颞叶痴呆。该变异体在体外和细胞模型中均表现出增强的tau纤维化和种子活性，为其致病性提供了机制基础。这项研究扩展了FTLD-MAPT的遗传变异谱，并强调了P301位点在tau蛋白致病性调控中的核心作用。
