**特级初榨橄榄油掺假检测中基于无表面活性剂微乳液与三维荧光光谱法的快速可持续方法**

《Oil Crop Science》：A rapid and sustainable method for the detection of extra-virgin olive oil adulteration using surfactant-free microemulsions and 3D spectrofluorimetry

　　

由于对制备标准、纯度和低产量的严格要求，特级初榨橄榄油（Extra-virgin olive oil, EVOO）是一种高价值产品，这使得用低品质油进行掺假成为一种常见做法。鉴于传统的质量控制技术依赖于昂贵的分析仪器和复杂的数据处理方法，因此需要更简单、快速和可持续的分析替代方案。在此背景下，本研究提出将三维荧光光谱法（3D spectrofluorimetry）与无表面活性剂微乳液（Surfactant-free microemulsions, SFMEs）相结合，作为检测EVOO中大豆油掺假的样品前处理策略。这些体系由油相、水相和短链醇组成，能够产生微观环境，在最小样品消耗下增强EVOO内源性荧光团（endogenous fluorophores）的荧光，同时降低交叉污染和内滤效应（inner filter effect, IFE）的风险。在本研究中，使用三种不同的醇构建了三元相图（ternary phase diagrams），并选择了正丙醇（propan-1-ol），因其能形成水含量更高的SFME，更适合EVOO分析。随后进行了测试，以确定含有EVOO（激发/发射波长（λ_ex/λ_em）：290/320 nm）和大豆油（λ_ex/λ_em：300/335 nm）的SFME的合适激发/发射波长。SFME制备的折中条件为：25 μL油相（样品：辛醇，1:3，v/v），750 μL水，正丙醇定容至最终体积5.00 mL。此外，评估了油样取样方式的影响，结果显示使用反向移液（reverse sample pipetting）代替直接移液可将相对标准偏差（relative standard deviation）降低60%，证明了其在处理如EVOO等高粘度样品时的有效性，且该效果不受分析人员经验水平的影响。在定性评估中，通过三维荧光光谱法分析了24个样品，包括橄榄油、大豆油和混合油（大豆油/EVOO）。为所有在SFME中制备的样品获取了激发-发射矩阵（λ_ex：200-350 nm，λ_em：250-400 nm）。在比较EVOO和大豆油样品时，观察到荧光强度和荧光指纹图谱（fluorescence fingerprint）的显著差异。在橄榄油样品之间，来自其他类别或未标明类别的样品也显示出明显差异，表明该方法不仅具有区分大豆油和EVOO的潜力，还能区分不同的橄榄油类别。在EVOO样品中添加不同水平大豆油（0, 25, 50, 75, 和 100%, v/v）的定量研究获得了高决定系数（coefficient of determination, R² = 0.9979），能够识别低至1%的掺假（检测限（limit of detection, LOD）为0.97%），并能精确准确地量化低至3%的掺假水平（定量限（limit of quantification, LOQ）为3.23%）。线性回归方差分析（ANOVA）显示统计学显著性和响应线性（p < 0.05）。曲线重复性测定的变异系数（coefficient of variation, CV）均低于5%，证明了该方法在定量分析中的潜在适用性。使用AGREE和分析生态标尺（Analytical Eco-Scale）指标进行的可持续性评估分别获得了0.71/1.00和84/100的满意分数，支持该方法不仅简单易懂，而且是一种环保的EVOO掺假检测方法。

橄榄油是食品和化妆品行业中广泛使用的产品，它通过溶剂萃取、物理过程或重整程序从油橄榄（*Olea europaea*）果实中获得。根据国际橄榄理事会（International Olive Council, 2025）的数据，全球每年生产超过250万吨橄榄油，西班牙和美国分别是主要的生产国和进口国。根据成分、提取和精炼程序，橄榄油被分为不同类别，如橄榄油、精炼橄榄油、油橄榄果渣油、灯用橄榄油、初榨橄榄油（Virgin olive oil, VOO）和特级初榨橄榄油，其中最后一类最受消费者重视。EVOO因其令人愉悦的感官特性以及存在与多种健康益处（包括免疫调节、抗炎、抗病毒和抗氧化作用）相关的酚类化合物和单不饱和脂肪酸而脱颖而出。此外，EVOO具有明确的最大游离酸度上限0.8%，这是其与VOO（允许的游离酸度可达2%）的主要区别。

EVOO的流行性和高质量，加上其低产量，使其成为一种具有高经济价值的产品。然而，其全球强劲的需求和有限的供应使其容易受到廉价植物油或低等级橄榄油的掺假。由于EVOO基质组成的复杂性，这种掺假的检测变得复杂，使得质量控制成为一个重大的分析挑战。因此，开发简单高效的分析方法非常可取。气相色谱法（Gas chromatography, GC）和高效液相色谱法（High-performance liquid chromatography, HPLC）是此类任务中最传统的方法。然而，全球趋势是开发能够在资源有限的实验室中轻松使用、并与绿色分析化学（Green analytical chemistry, GAC）原则相一致的方法，这已将重点从这些复杂且产生大量废物的方法转向更简单、更环保的方法。

荧光光谱技术是实现高效、低成本和更简单方法的合适替代方案，因其具有选择性、灵敏度以及低能耗和耗材需求。这些技术已被广泛使用，因为EVOO中存在生物活性荧光团分子，如酚类化合物、叶绿素、油酸、脱镁叶绿素以及维生素A、K和D。已有研究报道使用不同的荧光方法来识别和定量EVOO掺假。Dankowska和Ma?ecka（2009）基于同步荧光光谱法和多元回归，根据所用波长范围的不同，检测限为EVOO样品中8.4%和8.9%的橄榄油。尽管同步荧光被成功应用，但作者使用了神经毒性溶剂己烷来稀释样品。Jiménez-Carvelo及其合作者（2019）比较了荧光光谱法和近红外（Near-infrared, NIR）光谱法与化学计量学处理的结合，用于真实性和可追溯性目的，结果表明NIR在确定EVOO来源方面远优于荧光光谱法，但荧光光谱法在掺假检测方面提供了更好的结果。最近，do Nascimento Filho等人（2025）使用紫外诱导的荧光图像，并结合化学计量学处理，区分了EVOO中高达三种精炼植物油的掺假，准确率达到95.6%。同样在近期的研究中，Zaroual等人（2025）使用正面荧光光谱法，并用偏最小二乘判别分析（Partial least square discriminant analysis, PLS-DA）、主成分分析（Principal component analysis, PCA）和因子判别分析来分析光谱，用于相同的掺假目的，预测误差低至1.09%，相关系数高于0.995。然而，在最后三项研究中，复杂的化学计量学处理阻碍了对掺假的快速和简单检测，考虑到质量控制对快速响应的需求。

尽管荧光方法在识别和量化掺假方面取得了成功，但所有样品在分析前都用有机溶剂稀释或直接在仪器中测量。使用正己烷等有机溶剂稀释样品会产生有毒废物，这不符合绿色分析化学（GAC）原则。在直接分析中，EVOO和掺杂物的油性和粘性特性需要在样品之间对比色皿进行彻底清洗，通常需要大量有机溶剂，并且如果比色皿未清洗干净，仍可能导致交叉污染。此外，直接读数可能导致更明显的散射和内滤效应（IFE），这是由于EVOO中存在发色团物种。即使这种效应无法完全避免，但可以采取策略来将其最小化，以免影响分析质量。在这种背景下，使用微乳液（microemulsions, ME）可以是有利的，以缓解这些问题。

MEs是热力学稳定的体系，通过水相和油相与两亲性溶剂（通常是表面活性剂）自发形成或通过最小能量输入形成。然而，MEs也可以在不使用表面活性剂的情况下制备，使用具有类似两亲性的分子，如低链醇（甲醇、乙醇和正丙醇），被称为无表面活性剂微乳液（SFMEs）。该研究小组的前期研究表明，使用由正丙醇作为两亲性溶剂、水作为水相、辛醇和样品一起作为油相组成的伪三元体系，对于分析油性基质非常有效。形成的微观环境限制了荧光团的自由度，减少了非辐射过程，增强了荧光信号强度，从而提高了方法的灵敏度。辛醇在油相中的存在不仅有助于增强油相粘度，从而降低荧光团通过振动过程的能量损失，还提高了样品在目标体系中的溶解度，促进了具有更高水含量的ME的形成。此外，低样品消耗不仅在经济上具有优势，而且最大限度地减少了IFE，并使样品之间的清洗过程更容易。

在本研究中，使用无表面活性剂微乳液（SFMEs）通过对样品获取激发-发射荧光指纹图谱，能够轻松识别EVOO中不同水平大豆油的掺假。该方法快速、直接，结果易于理解，允许在这些高粘度样品中轻松识别掺假。此外，该方法还通过应用文献中可用的可持续性指标测试了其绿色性概况，以查看其与GAC的一致性以及与一些可持续发展目标（Sustainable Development Goals, SDGs）的符合程度。

**主要技术方法**
研究人员首先使用水、辛醇和三种短链醇（甲醇、乙醇、正丙醇）构建了三元相图（TPD），以确定无表面活性剂微乳液（SFME）的形成区域并选择合适的醇。接着，通过优化油相（样品与辛醇的比例）、水相体积，确定了SFME的折中制备条件。为解决高粘度样品的移液难题，对比了直接移液和反向移液（reverse pipetting）两种方式的精密度。定性分析中，使用三维荧光光谱法（λ_ex: 200-350 nm, λ_em: 250-400 nm）获取所有油样在SFME中的荧光指纹图谱。定量分析中，通过固定激发波长（λ_ex = 300 nm）测量发射光谱，以大豆油的特征发射波长（λ_em = 335 nm）处的信号强度构建校准曲线。最后，使用分析生态标尺（Analytical Eco-Scale）和分析绿色度指标方法（AGREE）对方法的可持续性进行评估。研究样本来源于在巴西当地市场购买的多个品牌和类别的橄榄油、大豆油及混合油。

**研究结果**
**三元相图：** 研究人员构建了以水、辛醇和短链醇为组分的三元相图。图谱显示，使用正丙醇作为两亲性组分时，在较低油相百分比下形成了相对较大的均相区域，该区域对应于水包油（O/W）型SFME，对于增强油性样品中荧光团的荧光强度、提高方法灵敏度特别有利。因此，正丙醇被选为后续研究中的两亲性化合物。

**SFME制备：** 在选定正丙醇的基础上，研究人员通过实验优化了SFME的具体条件。结果表明，当油相中样品（EVOO）与辛醇的比例为1:3（v/v），水的添加体积为750 μL，并用正丙醇定容至5.0 mL时，形成了稳定的均相体系。此外，对比不同经验水平的分析人员使用直接移液与反向移液的精密度发现，反向移液能显著降低相对标准偏差（RSD），分别从6.5%降至2.1%（低经验者）和从2.2%降至0.9%（高经验者），证明了反向移液在处理高粘度样品时能有效提高方法的重现性。

**荧光光谱分析：** 三维荧光测量结果显示，EVOO、大豆油和混合油在SFME中具有明显不同的荧光指纹图谱。EVOO样品的最强荧光区域在λ_ex/λ_em = 290/320 nm附近，而大豆油的最强区域在300/335 nm附近，且后者的荧光强度显著更高。这使得仅通过视觉对比指纹图谱即可初步判断掺假。此外，对不同来源和包装的EVOO样品分析表明，其指纹图谱高度相似，表明方法不受产地和包装影响。然而，属于其他类别（如VOO）或未明确分类的橄榄油样品则显示出与EVOO不同的指纹图谱，证明该方法具有区分不同橄榄油类别的潜力。

**定量分析：** 基于定性结果，研究人员构建了定量分析校准曲线。在SFME中制备了含有0%至100%（v/v）大豆油掺假水平的模拟样品，并在λ_ex/λ_em = 290/335 nm处测量荧光信号强度。线性回归分析获得了高决定系数（R² = 0.9979），检测限（LOD）为0.97%，定量限（LOQ）为3.23%。线性回归方差分析（ANOVA）确认了方法的统计显著性（p < 0.05），各点的变异系数（CV）均低于5%，表明该方法对EVOO中大豆油掺假水平的定量分析准确可靠。

**可持续性评估：** 采用分析生态标尺（Analytical Eco-Scale）评估，该方法因使用的试剂量少、能耗低而获得84/100的高分（>75分表示优秀）。使用分析绿色度指标方法（AGREE）评估，获得了0.71/1.00的评分，表明方法符合绿色分析化学原则。同时，该方法与联合国可持续发展目标（SDGs）中的第9（产业创新与基础设施）、12（负责任消费和生产）、14（水下生物）和15（陆地生物）项目标相一致。

**讨论与结论**
该研究提出的基于三维荧光光谱法与无表面活性剂微乳液（SFME）相结合的方法，为EVOO掺假检测提供了一种快速、简单且结果可视化的替代方案。SFME作为样品前处理手段，不仅实现了低样品消耗（对于高价值的EVOO尤为重要），还降低了因样品高粘度导致的交叉污染风险。体系的高稀释度有效缓解了内滤效应（IFE），保证了良好的线性关系。研究证实了反向移液技术在提高精密度方面的价值，尤其对经验较少的分析人员有益。荧光指纹图谱清晰地区分了大豆油与EVOO，且EVOO的指纹图谱不受原产国和包装类型影响，而其他类别橄榄油则显示出差异，表明该方法具有更广泛的应用潜力。优异的线性（R² = 0.9979）、低检测限和定量限、以及通过统计验证的准确性，证明了该方法在定量分析上的可靠性。可持续性评估的高分（AGREE：0.71/1.00；Eco-Scale：84/100）和与多个可持续发展目标的契合，突显了该方法在提供高效分析的同时，也践行了环保和可持续的原则。

总之，本研究成功开发了一种结合三维荧光光谱法与无表面活性剂微乳液的快速、可持续方法，用于特级初榨橄榄油中大豆油掺假的定性筛查和准确定量，为食品质量控制提供了有力的绿色分析工具。