原位核磁共振：通过创新核磁管插件实现的传输现象直接原位研究

《Analytical Chemistry》：InNMR: Direct In Situ Studies of Transport Phenomena Enabled by an Innovative NMR-Tube Insert

　　

一种新型圆盘状插件已被开发出来，该插件可利用配套的推杆工具定位至标准核磁共振（NMR）管中。通过将任意类型的半透膜屏障附着于插件底部，可将管的检测体积分隔为两个或多个由选定屏障隔开的腔室。随后利用切片选择性实验，通过 NMR 波谱法实时研究多种传输现象。本文展示了该技术装置及其在三个不同应用中的概念验证：渗透性研究、扩散控制的 pH 滴定以及扩散控制的蛋白质滴定。所开发的这种方法为从事药物发现、有机化学、生物化学、化学生物学、微生物学或电化学领域的研究人员解锁了新工具，使其能够通过 NMR 波谱法执行新型实验。

核磁共振（NMR）在管设计、独特实验设计及各种附件方面拥有丰富的创新历史，以获取新的实验参数。此类发展包括用于在液体 NMR 中提取偶极耦合的拉伸凝胶和压缩装置、用于反应监测的流动系统或通过在线液相色谱进行的分离，以及台式波谱仪中的超极化技术以增强灵敏度。NMR 量化多种状态或短寿命中间态中单个组分的能力，推动了原位 NMR 方法的发展和采用，这些方法在电池与材料研究及反应监测中具有广泛应用。通过这些时间分辨的原位 NMR 方法，可以揭示其他方法难以获得的机理见解，从而构建电池过程、反应机制和生物事件的详细模型。因此，原位 NMR 方法已成为强大的跨学科工具。

先前的关于药物递送和吸收的渗透性模型工作已确定 NMR 是渗透性测定的强大检测器。NMR 本质上是定量的，并且能够检测多种原子核。基于此，研究人员开发了一种简单灵活的插件，可将标准的 5 mm NMR 管分隔为由半透膜屏障隔开的两个不同体积。通过将插件定位在样品的检测体积内，可以利用空间分辨 NMR 波谱法实时单独观察这两个体积。这使得涉及跨越任何类型半透膜屏障传输的大量实验得以进行。

本文提出的新型插件由基于圆盘的设计组成，可通过摩擦力使用专门设计的推杆工具将其定位在标准 NMR 管内的任意高度。可粘贴多种类型屏障的插件圆盘通过 O 形圈形成水密密封。这使得两个腔室均能达到相同的波谱质量和灵敏度。该插件启用了一类新的扩散控制滴定实验，且费用极低。在此，研究人员描述了插件的细节，并证明了三种不同潜在应用的原理：渗透性、扩散控制的 pH 滴定以及配体 - 蛋白质相互作用的扩散控制滴定实验。

为了建立平行人工膜渗透性测定（PAMPA）屏障，首先制备脂质溶液，然后将薄层溶液涂覆在预先粘附在插件圆盘上的 Durapore 0.22 μm PVDF 过滤器上。管中首先填充受体缓冲液。将装有 PAMPA 的插件定位在检测体积中心。移除 PAMPA 屏障上方的缓冲液并精确测量其体积以确定受体腔室体积。随后，在 PAMPA 屏障上方加入供体溶液。立即将管放入波谱仪并开始采集。使用双脉冲场梯度自旋回波（DPFGSE）型脉冲序列采集切片选择性波谱，连续采集供体和受体腔室的切片选择性¹H 波谱 24–48 小时。 analyte 浓度相对于内部 TMSP 参考进行定量，并根据公式计算表观渗透率（P_app）。

为了在宽范围内控制 pH 值，使用了四种 pH 报告分子。制备了含有 Tris、甲酸铵、咪唑、乙酸、DSS 和 D₂O 的储备溶液。通过调整 pH 报告分子储备溶液的 pH 值（pH 2–12）获得 pH 校准曲线。滴定作为一次性实验进行。首先将稀释在 pH 报告分子储备溶液中的吡啶加入标准 5 mm NMR 管。用 HCl 酸化受体溶液以确保受体腔室呈酸性。插件圆盘装配有 3.5 kDa Spectra/Por 截留透析膜。插件被定位在管中远高于 NMR 检测体积的位置，以确保最小的波谱干扰。开始实验时，在插件上方加入 NaOH 供体溶液，立即将管转移至波谱仪，并在 1–2 小时内连续收集切片选择性¹H NMR 波谱。最终通过绘制目标分子的化学位移随溶液 pH 值变化的图来确定其 pK_a。每个波谱的 pH 值是利用预先建立的报告分子化学位移随 pH 值变化的校准曲线确定的。化合物的质子化（HA）和去质子化（A^?）状态在 NMR 时间尺度上快速交换，导致每个原子核产生一个 NMR 信号，其化学位移（δ）对应于 HA 和 A^?状态的加权平均值。绘制采集的 δ_obs 对 pH 值得出 sigmoidal 曲线，拐点处即为 pK_a。

首先将 alginate 降解蛋白 AlgE4R 作为受体溶液加入 5 mm NMR 管。插件装配有 12–14 kDa Spectra/Por 截留透析膜并定位在检测体积中间。插件上方的溶液由 8 M 尿素储备溶液组成，加尿素后立即将管放入波谱仪。为了监测尿素通过膜的扩散，对供体侧进行切片选择性¹H NMR，每 10–30 分钟收集一次波谱，持续约 20 小时。然后对每个波谱的尿素峰进行积分，将峰的绝对积分与尿素浓度相关联并绘制对每次采集时间的图。假设滴定结束时达到平衡，估算受体体积中的浓度。为了监测 AlgE4R 的展开，使用 BEST 序列进行标准¹H–¹⁵N HSQC 实验，每 10–30 分钟收集一次波谱，持续约 20 小时。定性分析 HSQC 波谱以评估 AlgE4R 的变性。

核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）技术在科学探索中占据重要地位，其在管设计、实验方案及配件方面的不断创新极大地拓展了实验参数的获取能力。从用于提取偶极耦合的拉伸凝胶到用于反应监测的流动系统，再到增强灵敏度的超极化技术，NMR 的发展历史悠久。特别是原位（in situ）NMR 方法，凭借其量化多状态或短寿命中间态组分的能力，已在电池材料研究、反应机理分析及生物事件建模等领域展现出巨大潜力，成为跨学科研究的有力工具。然而，现有的渗透性模型和传输现象研究仍面临挑战，传统的管中管（tube-in-a-tube）设计存在光谱质量不佳、灵敏度不均以及气液界面干扰等问题，限制了其在实时监测跨膜传输过程中的应用。此外，传统的滴定实验往往耗时费力，需要大量手动操作和样本制备，难以实现高时间分辨率的动态过程捕捉。因此，开发一种能够分割 NMR 管检测体积、实现实时双向监测且保持高光谱质量的新型装置显得尤为迫切。

针对上述问题，研究人员开发了一种创新的圆盘状插件（discoid insert），该插件可配合专用推杆工具灵活定位至标准 5 mm NMR 管内。通过在插件底部附着半透膜屏障，NMR 管的检测体积被有效划分为两个独立的腔室，且保持了相同的径向特性，消除了额外的玻璃 - 空气 - 玻璃界面，显著提升了光谱质量和灵敏度。结合切片选择性（slice-selective）NMR 实验技术，研究人员能够在实时条件下对跨越屏障的传输现象进行深入研究。本研究发表在《Analytical Chemistry》期刊上，不仅展示了该装置的技术细节，还通过三个概念验证实验——药物渗透性研究、扩散控制的 pH 滴定以及蛋白质 unfolding 滴定，证明了其在药物发现、生物化学及化学生物学等领域的广泛应用前景。

在研究方法方面，研究人员主要采用了三项关键技术。首先是精密机械设计与制造技术，利用聚醚醚酮（PEEK）材料高精度加工圆盘插件，并配备不锈钢推杆工具，确保插件在管内通过摩擦力和旋转机制实现稳固密封及无气泡安装。其次是切片选择性 NMR 波谱技术，利用双脉冲场梯度自旋回波（DPFGSE）脉冲序列，实现对 NMR 管内不同高度切片的精准激发和信号采集，从而独立监测供体和受体腔室内的化学变化。最后是扩散控制动力学实验设计，通过在两腔室间设置不同孔径的半透膜（如 PAMPA 脂质膜或透析膜），利用浓度梯度驱动分子扩散，实现无需中途手动干预的自动化长时间动态监测。样本来源主要包括模型药物（咖啡因、特布他林）、pH 指示剂混合物以及¹⁵N 标记的 AlgE4R 酶蛋白。

研究结果部分主要分为三个应用领域。在渗透性研究方面，研究人员构建了微型化的平行人工膜渗透性测定（PAMPA）系统。通过将脂质膜固定在插件上，实时监测了咖啡因和特布他林在供体和受体腔室间的浓度变化。结果显示，该方法能够以极高的时间分辨率捕捉药物渗透过程，测得咖啡因的表观渗透率（P_app）比特布他林高出一个数量级，且能同时监测供体浓度的衰减和受体浓度的积累，计算出极低的残留量，证明了物质传输的高效性和检测的准确性。在扩散控制的 pH 滴定研究中，研究人员利用插件将酸性受体溶液与碱性供体溶液隔开，通过透析膜控制碱液的缓慢扩散，在受体腔室内形成动态 pH 梯度。结合预先标定的 pH 报告分子（如甲酸盐、咪唑等），成功在 90 分钟内完成了吡啶的 pK_a测定，获得了数百个 pH 数据点，其结果与文献值高度吻合，显著提高了滴定效率并减少了人工操作误差。在配体滴定与蛋白质展开研究中，研究人员利用尿素作为变性剂，通过扩散控制的方式逐渐增加受体腔室中 AlgE4R 酶周围的尿素浓度。通过连续采集¹H–¹⁵N HSQC 波谱，高分辨率地记录了蛋白质从折叠态到完全展开态的动态过程，捕捉到了手动滴定可能遗漏的中间状态，确定了蛋白质展开的尿素浓度阈值约为 3.2–3.3 M。

讨论与结论部分指出，这种圆盘状插件克服了传统管中管设计的局限性，提供了卓越的光谱质量、重现性和灵敏度。该装置的核心优势在于其能够实现“一次性”（one-shot）实验，即样本预先制备完成后，所有数据采集均可自动化进行，无需额外的样本处理。这不仅极大地提高了时间分辨率，使得动态过程的精细采样成为可能，还为研究阈值效应、协同作用及纳米颗粒释放等复杂动力学过程提供了新手段。研究人员总结认为，该创新 NMR 管插件为药物渗透性筛选、物理化学常数测定以及生物大分子相互作用研究提供了一种通用且高效的平台，有望在多个化学与生物学分支领域推动新型实验范式的建立。