乙基丙二酸与甲基琥珀酸通过硫醇氧化还原调节破坏大鼠纹状体生物能量学并诱导线粒体通透性转换：乙基丙二酸脑病的潜在机制

《Neurochemical Research》：Ethylmalonic and Methylsuccinic Acids Disrupt Bioenergetics and Induce Mitochondrial Permeability Transition Through Thiol Redox Modulation in Rat Striatum: Potential Mechanisms Involved in Ethylmalonic Encephalopathy

　　

乙基丙二酸（EMA）和甲基琥珀酸（MSA）在乙基丙二酸脑病（EE）患者组织和体液中浓度升高，EE是一种与基底神经节异常相关的线粒体疾病。为了阐明该疾病的病理生理学，研究人员评估了EMA和MSA对大鼠纹状体生物能量学、氧化还原稳态和线粒体通透性转换（MPT）的影响。研究验证了EMA和MSA降低了状态3和解偶联呼吸，并抑制了α-酮戊二酸脱氢酶（α-KGDH）和电子传递链（ETC）复合物IV的活性。这两种有机酸还降低了线粒体膜电位和Ca²⁺保留能力，而环孢菌素A（CsA）和ADP可使其正常化，表明它们诱导了MPT孔道开放。N-乙基马来酰亚胺（NEM）和二硫苏糖醇（DTT）进一步缓解了这些效应，提示MPT孔道的硫醇基团被EMA和MSA氧化。此外，EMA和MSA轻微降低了还原型谷胱甘肽（GSH）浓度，进一步证实了这些有机酸氧化了硫醇基团。因此，研究人员推测，EMA和MSA诱导的生物能量损伤伴随MPT孔道开放，参与了EE中观察到的基底神经节损伤的病理生理过程。

乙基丙二酸脑病（EE）是一种罕见的线粒体疾病，由编码乙基丙二酸脑病1蛋白（ETHE1）的ETHE1基因突变引起。ETHE1是一种线粒体铁依赖性双加氧酶，在降解硫化氢（H₂S）中起关键作用。因此，ETHE1活性缺陷导致受累个体组织中硫化物及其衍生物硫代硫酸盐的积累。患者还表现出源自丁酰辅酶A（CoA）羧化的乙基丙二酸（EMA）浓度升高，以及C4-和C5-酰基肉碱酯升高，这是由于硫化物抑制了短链酰基辅酶A脱氢酶（SCAD）所致。值得注意的是，EMA是积累最多的代谢物，在尿液中大量排泄（60–930 mmol/mol肌酐；正常< 17）。甲基琥珀酸（MSA），一种EMA的异构体，排泄浓度也较高，但远低于EMA（2-200 mmol/mol肌酐；正常< 12）。EE患者在生命早期出现严重的神经系统表现，如精神运动倒退、从肌张力低下演变为肌张力亢进的全身性婴儿低张力、全身性强直阵挛性癫痫发作、进行性痉挛和痉挛性四肢瘫。还常见泛发性微血管损伤伴瘀点性紫癜、粘膜表面出血性渗出和慢性血性腹泻。神经影像学显示，与其他脑区相比，基底神经节病变是EE的一个独特且常见的异常。其他特征包括齿状核和脑干异常、皮质萎缩以及可发展为弥漫性脑白质病的脑室周围和小脑白质改变。也有报道存在脑部复合血管改变、神经元丢失、神经胶质增生和血管密度增加。治疗仍然有限且主要是支持性的。主要基于使用抗痉挛剂、肌肉松弛剂和抗癫痫药物来控制神经系统表现。另一种对阻止疾病进展和改善代谢异常显示积极效果的治疗选择是联合使用N-乙酰半胱氨酸（NAC），一种还原型谷胱甘肽（GSH）的前体，与抗生素甲硝唑，一种减少肠道硫化氢产生的杀菌剂。限制含硫氨基酸的低蛋白饮食也与代谢和临床改善相关，特别是当与NAC和甲硝唑联合使用时。最后，严重表型的患者从肝移植中获益。

尽管EE的病理生理学尚未完全确立，但越来越多的证据表明，积累的代谢物，包括EMA，引发了影响线粒体生物能量学和氧化还原稳态的显著毒性。具体关于EMA的作用，据报道EMA损害大鼠脑中柠檬酸循环（CAC）和电子传递链（ETC）的功能。EMA还抑制琥珀酸和苹果酸向线粒体的转运，并诱导线粒体通透性转换（MPT）。此外，EMA增加活性氧（ROS）水平，诱导脂质和蛋白质氧化损伤，并损害大鼠脑的抗氧化防御。

鉴于EE的病理机制仍知之甚少，且有证据表明EMA损害线粒体稳态，本研究旨在探讨EMA及其结构类似物MSA对年轻大鼠纹状体中线粒体生物能量学、MPT和氧化还原稳态的体外影响。同时评估了线粒体钙（Ca²⁺）保留能力。最后，进行了计算机模拟（in silico）分析以阐明参与EMA和MSA作用的机制。

本研究使用总计168只30日龄雄性Wistar大鼠（RRID: RGD_13508588），来源自南里奥格兰德联邦大学（UFRGS）实验动物繁殖与实验中心（CREAL）。动物饲养在12:12小时明暗周期、温度控制（22?±?1?°C）的房间中，自由饮水和摄食含20%（w/w）蛋白质的商业饲料。所有实验严格遵循《实验动物护理和使用指南》（第8版，2011）并经UFRGS伦理委员会批准（编号47219）。研究人员通过断头处死大鼠，快速分离纹状体制备匀浆、上清液和线粒体部分。

研究结果首先显示，EMA降低了纹状体线粒体部分的呼吸。EMA显著降低了在存在丙酮酸、苹果酸和谷氨酸（PMG）（与NADH相关的底物）条件下线粒体呼吸的状态3，以及在存在PMG加琥珀酸（S）（与NADH和FADH₂相关的底物）条件下的状态3。此外，EMA降低了仅由琥珀酸刺激的解偶联呼吸。相比之下，EMA未改变状态4和由PMG+S驱动的解偶联呼吸。研究还验证了MSA在仅存在琥珀酸时有降低解偶联呼吸的趋势，但其他呼吸参数未受MSA影响。

进一步研究发现EMA和MSA损害CAC和ETC功能。两种有机酸均显著降低了α-KGDH活性，但未改变CS、MDH和SDH的活性。关于ETC复合物，EMA和MSA显著降低了纹状体中复合物IV的活性，其中MSA的抑制作用更强，而复合物I、II和II-III的活性未受这些代谢物改变。

计算机模拟分析了MSA与α-KGDH的E1和E3亚基以及二羧酸、谷氨酸和α-酮戊二酸/苹果酸线粒体载体的相互作用。结果显示MSA可以占据α-KGDH活性位点，并与参考抑制剂TD71重叠。MSA还占据E3亚基中靠近辅因子FAD、NAD和硫辛酸的区域。此外，MSA可能与琥珀酸结合到二羧酸载体以及与谷氨酸结合到谷氨酸载体的位点相互作用，表明MSA可以与生理底物竞争，损害柠檬酸循环中间体的供应和基本的回补过程。

EMA和MSA使纹状体线粒体部分中由琥珀酸维持的线粒体膜电位（ΔΨ_m）消散。在补充了Ca²⁺的纹状体线粒体中，两种有机酸均使膜电位消散，而环孢菌素A（CsA）和ADP的组合阻止了这种消散，表明两种有机酸都触发了MPT孔道开放。

EMA降低了纹状体线粒体部分的Ca²⁺保留能力。暴露于EMA和MSA显著降低了由琥珀酸维持的线粒体的Ca²⁺保留能力，这种效应被CsA和ADP的存在所阻止。进一步评估NEM和DTT对EMA和MSA引起的Ca²⁺保留能力降低的影响表明，NEM和DTT完全阻止了EMA对此参数的影响，并减弱了MSA诱导的效应。这些结果表明参与该保留的成分中存在氧化作用。

最后，研究考察了EMA和MSA对纹状体上清液中抗氧化防御系统的影响。两种有机酸均显著降低了GSH水平，但未改变GPx和SOD活性。在纹状体线粒体部分中也验证了两种酸均降低了GSH水平。

综上所述，本研究通过体外实验证明，EE中积累的代谢物EMA和MSA能够损害大鼠纹状体的线粒体生物能量学，其机制涉及抑制α-KGDH和复合物IV活性，并通过引起硫醇基团氧化修饰诱导MPT开放，同时破坏线粒体Ca²⁺稳态和抗氧化防御。这些发现为理解EE中基底神经节易损性的病理机制提供了重要的实验依据。