《RSC Advances》：Optimization of ultrasound-assisted extraction and biological activities of Crataegus monogyna Jacq. flowering branches using experimental design and artificial neural networks
研究人员旨在评估提取参数，包括溶剂浓度、提取时间、温度和料液比，对单子山楂花枝提取物中总酚、总黄酮、抗氧化（DPPH (2,2-二苯基-1-苦肼基)、ABTS (2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))、FRAP (铁离子还原抗氧化能力) 和 CUPRAC (铜离子还原抗氧化能力)) 以及酶抑制（α-淀粉酶和酪氨酸酶）性质的影响。此外，应用了人工神经网络 (ANN) 模型来优化提取条件。结果表明，提取条件显著影响其化学成分和生物活性。最优条件（70% 乙醇，30分钟，45°C，1?:?30）所得提取物具有高总酚含量（109.15 mg GAE/g）和总黄酮含量（70.74 mg RE/g），强抗氧化活性（DPPH：473.57 mg TE/g，ABTS：537.58 mg TE/g，CUPRAC：407.11 mg TE/g，FRAP：393.91 mg TE/g）和显著的酶抑制潜力（抗α-淀粉酶：0.53 mmol ACAE/g，抗酪氨酸酶：75.00 mg KAE/g）。ANN模型表现出优异的预测性能，证实了其在复杂提取系统建模和优化中的适用性。本研究利用实验设计和ANN模型，为从单子山楂花枝中通过优化超声辅助提取方法回收最大生物活性化合物和生物活性（抗氧化及酶抑制效应）提供了全面见解。这些发现为开发功能性及药品提供了可靠依据。
植物来源的天然产物仍然是具有重要药理和生物医学潜力的生物活性化合物的重要来源。几个世纪以来，药用植物在全球传统医学体系中一直被用作治疗各种急性和慢性疾病的治疗剂。现代植物化学和药理学研究已从植物中识别出众多生物活性成分，并阐明了其许多作用机制，支持其在现代医药和医疗应用中的日益整合。在药用植物中，单子山楂 (Crataegus monogyna Jacq.) 因其广泛的生物活性和在传统及现代植物疗法中的广泛使用而备受关注。作为蔷薇科 (Rosaceae) 的成员，单子山楂广泛分布于亚洲、非洲和欧洲的多个地区。它是生物活性化合物的著名来源，包括多酚类，如绿原酸、表儿茶素、异槲皮苷和原花青素，以及三萜酸，如齐墩果酸和熊果酸。由于其复杂的植物化学成分，单子山楂表现出多种药理特性，包括心脏保护、肝脏保护、抗糖尿病、抗氧化和抗炎作用。在传统医学中，该植物的不同部位已被用于治疗心血管疾病、失眠、呼吸系统疾病、胃肠道疾病和泌尿系统疾病。
植物提取物的生物活性和化学成分受提取程序和操作条件的强烈影响。提取效率取决于几个参数，包括溶剂组成、温度、植物与溶剂的比例和提取时间。近年来，现代提取技术已被越来越多地应用于提高提取率并减少加工时间和能源消耗。其中，超声辅助提取 (UAE) 因其简便性、快速提取以及适用于实验室和工业应用而成为一种高效且环保的技术。然而，尽管具有优势，UAE仍需要仔细优化工艺条件。超声处理可能诱导空化效应、局部温度升高、自由基形成和热敏性化合物的降解，这可能对提取效率和目标生物活性成分的稳定性产生负面影响。因此，优化提取参数对于在保持其功能特性的同时实现生物活性化合物的高回收率至关重要。
已有几项研究探讨了单子山楂的提取程序优化。Martín-García 等人 (2021) 使用 Box–Behnken 设计优化了单子山楂叶片的超声辅助提取条件，以最大化酚类含量。Mehmood 等人 (2024) 研究了利用单子山楂叶提取物生物合成银纳米颗粒的反应参数。此外，Shortle 等人 (2013) 报道了单子山楂叶片、花和浆果提取物的超临界流体萃取的最佳条件。然而，针对单子山楂花枝的研究，特别是关于酶抑制活性和先进的预测建模方法，仍然非常有限。
因此，本研究旨在研究提取参数对通过超声辅助提取获得的单子山楂花枝提取物提取率、总酚含量和生物活性的影响。此外，应用了人工神经网络 (ANN) 建模来评估和预测提取条件对与糖尿病相关的酶（α-淀粉酶）和皮肤疾病（酪氨酸酶）的抑制活性及抗氧化活性的影响。据研究人员所知，这是第一项利用基于 ANN 的建模研究提取条件对单子山楂花枝提取物 α-淀粉酶和酪氨酸酶抑制活性影响的研究。
单子山楂材料于2024年5月采自土耳其通杰利省 (Tunceli) (Pertek Dereba?? mah, 实验动物研究中心附近)。植物材料由 U?ur ?ak?lc?o?lu 博士鉴定，凭证标本存放于 Munzur 大学标本馆（凭证号：UC-24-47）。收集的材料（带花和叶的枝条）在室温下阴干十天，随后使用实验室磨粉机粉碎。超声辅助提取 (UAE) 使用不同浓度的乙醇（50%，70% 和 90%），提取时间为三个水平（15分钟、30分钟和45分钟）。此外，应用了三个提取温度（30°C，45°C 和 60°C）和植物溶剂比（1:15, 1:30, 1:45）。所得提取物经过过滤，并在40°C下真空蒸发溶剂。所有提取物在进一步分析前于+4°C储存。
总生物活性化合物（总酚和总黄酮含量）和生物活性（抗氧化和酶抑制）通过分光光度法测定：分别为 Folin-Ciocalteu 和 AlCl3 测定法。结果以没食子酸当量（mg GAE/g 提取物）表示总酚，以芦丁当量（mg RE/g 提取物）表示总黄酮。抗氧化能力通过自由基清除试验（DPPH 和 ABTS）和还原力试验（CUPRAC 和 FRAP）进行评估。抗氧化活性以 Trolox 当量（mg TE/g 提取物）表示。还评估了对酪氨酸酶和α-淀粉酶的酶抑制活性。酪氨酸酶抑制活性以曲酸当量（mg KAE/g 提取物）表示，α-淀粉酶抑制活性以阿卡波糖当量（mmol ACE/g 提取物）表示。
数据的统计分析使用 StatSoft Statistica 10.0? 软件进行。为了可视化变量之间复杂的相互作用，在 R 软件 v.4.0.3（64位）中生成了颜色相关图，圆圈直径和颜色强度代表相关系数。应用了从蓝色到红色的渐变色阶，其中蓝色表示正相关，红色表示负相关。为评估实验数据的显著性，进行了单因素方差分析 (ANOVA)，并采用 Tukey 事后检验在95%置信水平（p < 0.05）下识别观察参数之间的统计学显著差异。所有测量均进行三次重复，结果以平均值 ± 标准差表示。
人工神经网络 (ANN) 模型使用多层感知器 (MLP) 架构开发，该架构以其卓越的非线性函数逼近能力而闻名。为每个观察到的输出开发了单独的ANN模型，包括得率、总酚含量 (TPC)、总黄酮含量 (TFC)、抗氧化试验（DPPH, ABTS, CUPRAC, 和 FRAP）和酶抑制活性（α-淀粉酶和酪氨酸酶）。在模型构建之前，输入和输出数据集均进行了归一化，以优化计算效率和预测稳定性。为确保模型在有限样本量（N = 27）下的稳健性，数据被划分为训练集（60%）、测试集（20%）和验证集（20%），并进行100,000次运行以根据最高的预测性能和最小的错误率确定最佳配置。ANN的内部架构由权重矩阵和偏置向量表征，其中 W1 和 B1 对应于隐藏层，W2 和 B2 对应于输出层。输入变量与预测响应之间的数学关系定义如下：Y = f1(W2·f2(W1·X + B1) + B2) (1)。在此方程中，Y代表输出矩阵，X是输入参数矩阵，f1 和 f2 分别表示隐藏层和输出层的传递函数。在学习周期中，权重系数 W1 和 W2 被迭代优化以最小化实验值和预测值之间的残差误差，从而最大化模型的可靠性。针对得率、TPC、TFC、DPPH、ABTS、CUPRAC、FRAP、α-淀粉酶和酪氨酸酶这九个参数的预测和优化，开发了九个ANN模型，输入变量为溶剂浓度、时间、温度和料液比。
开发的ANN模型的预测准确性和可靠性使用统计性能指标进行验证，包括决定系数 (r
2)、约化卡方 (χ
2)、平均偏差误差 (MBE)、均方根误差 (RMSE) 和平均百分比误差 (MPE)。这些参数通过应用以下数学方程得出：x
exp,i 表示实验值，x
pre,i 表示模型获得的值，N 和 n 分别是观测值和常数的数量。
总酚含量 (TPC) 在测试条件下表现出中等程度的变化，范围从 94.42 到 113.04 mg GAE/g 提取物。总体而言，TPC值相对较窄的范围表明所有应用的超声辅助提取 (UAE) 条件对酚类提取都是有效的，工艺参数的影响中等。稍高的TPC值通常与较低的乙醇浓度和中等至较高的温度相关，表明这些条件可能有利于提取更广泛的酚类化合物。样本之间没有显著差异表明，酚类提取是由多个参数的综合作用而非单一主导因素控制的。本研究中获得的总酚含量低于 ülger 等人 (2023) 报告的数值（116.24 至 301.77 mg GAE/g）。这些差异可能归因于提取条件的变化，包括溶剂组成和工艺参数。已有广泛报道称，酚类和黄酮类含量受提取方法、地理来源、基因型和植物材料生长阶段等因素的显著影响。相比之下，本研究获得的TPC值高于 Parzhanova 等人 (2023) 报告的单子山楂果实的数值，表明花枝可能代表更丰富的酚类化合物来源。
与TPC相比，总黄酮含量 (TFC) 表现出更大的变化，范围从 43.33 到 78.79 mg RE/g 提取物。某些样本中观察到的TPC和TFC之间的反向趋势表明，非黄酮类酚类对总酚含量贡献显著，并且提取条件可能选择性地有利于酚类化合物的不同亚类。特别是，较高的乙醇浓度似乎促进黄酮类的提取，而较低的浓度可能有利于更广泛的酚类成分。从机理角度来看，这种行为可归因于超声辅助提取 (UAE) 诱导的细胞壁破裂和空化效应，这些效应增强了传质，但也会根据不同酚类部分在植物组织中的极性和结合形式差异性地释放细胞内酚类馏分。类似的趋势在以前针对不同植物的研究中已有报道，其中溶剂极性被认为是影响提取过程中酚类亚类选择性的关键因素。这些发现证实，单独的TPC并不能完全代表提取物的组成，而是反映了结构多样的酚类基团的综合贡献。与TPC相比，TFC的更大变异性进一步表明黄酮类对提取参数的变化更为敏感。从实际角度来看，这些结果突出了根据所需的生物应用定制提取条件以获得富集总酚或特别是黄酮类馏分的提取物的可能性。
单子山楂提取物的抗氧化活性，使用DPPH、ABTS、CUPRAC和FRAP法评估，显示出中等程度的变异性，具体取决于提取条件。DPPH值范围为421.88至476.06 mg TE/g提取物，在样本1中观察到最高活性，其次是样本25、6和7。最低活性记录在样本8。ABTS观察到类似的趋势，数值范围为457.32至548.62 mg TE/g提取物，其中样本1和样本7表现出最高活性，而样本8再次显示最低值。CUPRAC和FRAP试验遵循可比较的模式，在样本25和13中观察到最高的还原能力，而在样本8和17中记录了最低值。不同抗氧化试验之间的一致性表明，观察到的变异不是试验特异性的，而是反映了提取物化学成分的真实差异。值得注意的是，表现出较高抗氧化活性的样本通常对应于那些具有较高总酚含量的样本，证实了酚类化合物对抗氧化潜力的重要贡献。然而，这种关系并非严格线性，表明抗氧化活性不仅取决于酚类的总量，还取决于其组成和结构特征。不同酚类亚类具有不同的氧化还原性质，这可以解释在具有相似TPC值的样本之间观察到的差异。样本中抗氧化活性的相对适中变化进一步支持了UAE作为提取技术的稳健性，在各种条件下都能有效回收抗氧化化合物。总体而言，结果表明单子山楂提取物表现出持续的高抗氧化潜力，主要由酚类化合物驱动，同时提取条件的细微变化允许对抗氧化效率进行微调。
单子山楂提取物对α-淀粉酶和酪氨酸酶的酶抑制活性显示在表中。α-淀粉酶抑制活性表现出相对较低的变异性，范围从0.45到0.66 mmol ACAE/g提取物。在样本2和4中观察到最高抑制，而在样本21和27中记录了最低活性。类似地，酪氨酸酶抑制显示出较窄的数值范围，从73.30到77.75 mg KAE/g提取物，在样本9中观察到最高活性，其次是样本6和8，而在样本27中记录了最低值。不同提取条件下酶抑制的有限变异性表明，负责这些活性的生物活性化合物在所有应用的UAE条件下都能被有效提取。这表明，与黄酮类不同，酶抑制活性对测试范围内提取参数的变化不太敏感。尽管已知酚类化合物有助于酶抑制，但未观察到总酚含量与酶抑制活性之间的明显直接相关性。这表明特定的化合物或酚类亚类，而非总酚含量，在酶抑制中起主导作用。观察到的α-淀粉酶抑制活性突出了单子山楂提取物在血糖控制相关应用中的潜力，而酪氨酸酶抑制表明其在化妆品配方和皮肤相关应用中可能的用途。样本中相对稳定的抑制谱表明，无需高度限制性的提取条件即可可靠地获得生物活性。总体而言，结果表明单子山楂提取物具有持续的酶抑制潜力，对提取参数的敏感性有限，表明负责这些效应的关键生物活性成分在各种UAE条件下易于提取。
相关性分析表明，总酚含量是单子山楂提取物抗氧化能力的主要决定因素。总酚与 FRAP (r = 0.808)、ABTS (r = 0.763)、CUPRAC (r = 0.762) 和 DPPH (r = 0.529) 之间观察到强正相关 (p < 0.001)，表明酚类化合物主要贡献于还原力和自由基清除活性。抗氧化试验之间也存在强烈的相关性，特别是 FRAP 和 CUPRAC (r = 0.837)，证实了方法论的一致性和相似的电子转移机制。相比之下，提取率与总黄酮 (r = ?0.436, p < 0.001)、DPPH (r = ?0.304, p = 0.006) 和 CUPRAC (r = ?0.269, p = 0.015) 显示出显著的负相关，表明较高的质量回收率并不对应于较高的生物活性效价，并可能反映非酚类成分的共提取。总黄酮与酪氨酸酶抑制呈正相关 (r = 0.256, p = 0.021)，而酶抑制活性与抗氧化参数通常表现出弱或不显著的相关性，表明这些生物效应可能由特定化合物而非总酚浓度单独支配。总体而言，结果表明酚类含量是抗氧化活性的主要贡献者，而酶抑制涉及更具选择性的植物化学相互作用。
使用完全连接法和城市街区（曼哈顿）距离进行了层次聚类分析，以客观地根据其多参数谱将27个提取物分组，揭示了两个主要聚类，强调了提取条件对生物活性组成的影响。第一个主要聚类的特点是具有高抗氧化效力的样本，特别是样本1、7和13（均为50%乙醇），由于其一致的高酚含量和优异的ABTS值而显示出最短的连接距离。第二个主要聚类包含具有更高得率和特殊酶抑制作用的提取物；在该组内，样本20和24紧密相连，反映了它们作为研究中最高得率提取物的共同特征。此外，90%乙醇提取物的独特亚分支，如在样本2、4和14中所见，证实了溶剂浓度是区分提取物的决定性因素，有效地将那些具有高酶抑制潜力的提取物与那些具有高整体得率的提取物分开。树状图中心样本25、26和27之间的高度相似性从统计学上验证了中间条件下提取过程的可重复性。
使用主成分分析 (PCA) 对27个提取物样本进行的多变量评估揭示了三个主成分解释了64.97%的总方差，有效地阐明了提取参数——乙醇浓度、时间、温度和料液比——与其产生的化学谱之间的相关性。PC1占方差的34.60%，主要根据抗氧化密度区分样本，其中使用50%乙醇获得的提取物（例如，样本1、7和13）表现出最高的酚含量（高达113.04 mg GAE/g）和优异的抗氧化能力（ABTS和CUPRAC），在双图的最左侧聚类。PC2解释了20.05%的方差，并根据提取时间和料液比进一步区分样本。较长的提取时间和较高的比例倾向于使样本沿PC2的正方向移动，其中与酶抑制活性（α-淀粉酶和酪氨酸酶）的关联更强。载荷矢量的方向表明抗氧化试验之间存在中度至强相关性。同时，酶抑制活性表现出部分独立的模式，表明不同的化合物组可能负责这些活性。
开发了人工神经网络 (ANN) 来建模观察到的响应，包括得率、TPC、TFC、抗氧化试验（DPPH, ABTS, CUPRAC, 和 FRAP）和酶抑制活性（α-淀粉酶和酪氨酸酶）。构建了九个单独的ANN模型（ANN1–ANN9）。为每个响应变量开发单独的ANN模型提高了预测性能，因为每个网络可以捕获每个响应特有的模式、数据范围和变异性。这种策略允许模型架构、隐藏层配置和权重优化针对每个输出进行定制，避免了在单个网络中同时拟合多个响应时可能出现的精度损失。根据ANN优化结果，隐藏层中最佳神经元数量分别为5、6、8、7、6、10、4、8和6，对应于MLP 4–5–1、MLP 4–6–1、MLP 4–8–1、MLP 4–7–1、MLP 4–6–1、MLP 4–10–1、MLP 4–4–1、MLP 4–8–1和MLP 4–6–1架构。在训练阶段，模型获得了较高的决定系数 (r
2)，范围从0.813到0.996。
所提出的ANN模型的性能使用几个指标进行评估，包括约化卡方 (χ
2)、均方根误差 (RMSE)、平均偏差误差 (MBE)、平均百分比误差 (MPE) 和决定系数 (r
2)。结果显示，对于大多数研究参数具有高度的预测准确性，特别是对于得率 (r
2 = 0.994) 和 ABTS (r
2 = 0.972)。得率模型的异常低的约化χ
2和RMSE值表明实验数据与预测数据近乎完美匹配。类似地，对于TPC、DPPH和CUPRAC的高决定系数 (r
2 > 0.900) 表明神经网络有效地捕获了这些抗氧化试验中固有的非线性关系。然而，对于 FRAP (r
2 = 0.558) 和酪氨酸酶 (r
2 = 0.694) 的模型性能显著较低，具有较高的RMSE和χ
2值，表明这些特定的生物活性可能受到复杂的协同效应或实验噪声的影响，而当前的网络架构发现难以映射。总体而言，所有变量中可忽略的MBE证实模型没有遭受显著的系统性高估或低估，验证了ANN作为稳健工具用于优化和预测大多数分析的输出参数。
基于表中呈现的数据，对ANN输出进行了优化，应用公式(1)。目标是最大化单子山楂花枝提取物的提取率、总酚含量、总黄酮含量、抗氧化活性（DPPH, ABTS, CUPRAC, 和 FRAP）和酶抑制活性（α-淀粉酶和酪氨酸酶）。ANN模型包括溶剂浓度、提取时间、温度和料液比作为输入变量。使用八个模型（ANN1–ANN8）进行优化，经过69–94代。每个输入变量应用100的种群大小，并沿Pareto前沿选择50个解。所有ANN模型都确定样本25为最佳提取物。优化结果进一步使用标准分数 (Z-score) 分析进行验证，根据方法计算了所有评估响应的平均Z分数。样本25表现出最高的整体Z分数（0.78），确认其为最佳提取条件。该提取物代表了抗氧化能力和酶抑制潜力之间的最佳平衡，证明了基于ANN的优化方法在定义最佳提取参数方面的稳健性和可靠性。
ANN模型优化和标准分数分析确定样本25为最佳提取物。该样本使用溶剂浓度70%、45°C下UAE 30分钟、料液比1?:?30获得，得率为24.51%。
该最佳单子山楂花枝提取物样本的测量值如下：总酚：109.15 ± 2.88 mg GAE/g；总黄酮：70.74 ± 1.18 mg RE/g；抗氧化试验：DPPH：473.57 ± 0.44 mg TE/g，ABTS：537.58 ± 3.87 mg TE/g，CUPRAC：407.11 ± 15.65 mg TE/g，FRAP：393.91 ± 1.88 mg TE/g；酶抑制试验：α-淀粉酶抑制：0.53 ± 0.01 mmol ACE/g提取物，酪氨酸酶抑制：75.00 ± 0.21 mg KAE/g提取物。
本研究表明，提取参数，特别是溶剂浓度、温度和料液比，在决定单子山楂提取物的化学成分和生物活性方面起着关键作用。具体而言，使用50%乙醇获得的提取物表现出最高的总酚含量和抗氧化能力，证实了酚类化合物对抗氧化性能的关键贡献。相比之下，酶抑制活性表现出更具选择性的行为，表明涉及特定的生物活性成分而非总酚水平。开发的ANN模型（用于得率的MLP 4–5–1和用于TPC的MLP 4–6–1）表现出高预测准确性，证实了其适用于建模复杂的非线性提取过程并实现可靠优化。最佳提取条件（70%乙醇，30分钟，45°C，1?:?30比例）产生了具有平衡生物活性化合物和生物活性谱的提取物。总体而言，本研究为提取过程的合理优化提供了一个稳健的框架，并突出了单子山楂花枝作为未来药用和功能性应用的有价值的生物活性化合物来源的潜力。
