Zeb2通过调控星形胶质细胞增殖与分化控制视网膜生理性与病理性血管生成

《Cell Proliferation》：Zeb2 Controls Retinal Physiological and Pathological Angiogenesis by Regulating Astrocyte Proliferation and Differentiation

　　

视网膜血管生成依赖于星形胶质细胞与内皮细胞（endothelial cells, ECs）之间精确时序的相互作用，但这一复杂神经血管对话背后的转录调控程序仍知之甚少。本研究将Zeb2定义为一个关键的视网膜星形胶质细胞功能转录调节因子，协同调控发育期与病理性血管生长。在发育过程中，Zeb2在视网膜星形胶质细胞前体细胞（astrocyte progenitor cells, APCs）中瞬时表达，并在病理性缺氧条件下被重新诱导。在视网膜星形胶质细胞中条件性敲除Zeb2，通过上调VEGFA（血管内皮生长因子A）并改变其他信号传导，增强了其增殖、迁移和成熟，导致发育期浅表血管生长过度。在氧气诱导视网膜病变（oxygen-induced retinopathy, OIR）模型中，Zeb2的失活加剧了病理性新生血管形成，同时损害了修复性再血管化，这与一种倾向于丛状ECs（tuft ECs）而非尖端ECs（tip ECs）的转录特征相关。在机制上，Zeb2抑制了神经毒性A1型星形胶质细胞的特性，导致炎症反应减弱，以及促进再血管化和/或防止新生血管形成的遗传程序（包括Plxnd1、Nrf2和FGF2信号通路）下调。这些发现确立了Zeb2作为星形胶质细胞功能的一个氧气敏感调节因子，其差异性地调控生理性与病理性血管生成，凸显了其作为增殖性视网膜病变治疗靶点的潜力。

视网膜血管生成对于维持正常视觉功能至关重要，其紊乱是导致糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）和早产儿视网膜病变（retinopathy of prematurity, ROP）等致盲性眼病的主要原因。星形胶质细胞作为中枢神经系统（central nervous system, CNS）的重要组成部分，不仅支持和分隔神经元，还在血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）形成中发挥关键作用。在视网膜中，星形胶质细胞通过提供物理支架网络和分泌促血管生成因子，在引导血管生长和模式形成中扮演核心角色。然而，星形胶质细胞如何精确调控血管生成的分子机制，尤其是在生理与病理条件下的不同作用，仍是一个未充分解答的科学问题。因此，深入探究星形胶质细胞调控视网膜血管生成的分子机制，对于理解相关疾病的发病机理并开发新的治疗策略具有重要意义。

锌指E盒结合同源框2（zinc finger E-box binding homeobox 2, Zeb2）转录因子，又称SIP1，是调控细胞命运决定、分化和上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）的关键因子，在多种发育背景下发挥重要作用。ZEB2基因突变导致人类Mowat-Wilson综合征，伴有神经发育缺陷和眼部异常。既往研究揭示了Zeb2在中枢神经系统（如皮质发生、髓鞘形成）和周围神经系统（如施万细胞分化）中的关键功能，但其在视网膜星形胶质细胞中的表达模式和功能意义尚不清楚。本研究旨在阐明Zeb2在视网膜星形胶质细胞发育过程中的时空表达模式，并通过构建星形胶质细胞特异性条件性基因敲除小鼠模型，探究其在视网膜星形胶质细胞中的具体功能，以及其缺失对生理性血管发育和病理性血管反应的影响。

研究人员利用GFAP-Cre驱动子与Zeb2^fl/fl小鼠杂交，构建了星形胶质细胞特异性Zeb2条件性敲除（Zeb2CKO）小鼠。通过免疫荧光染色、EdU掺入实验、视网膜铺片和切片分析、氧气诱导视网膜病变（OIR）模型构建、RNA测序（RNA-seq）、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Western blot、染色质免疫沉淀（ChIP）、CUT&Tag分析、双荧光素酶报告基因实验以及原代星形胶质细胞培养与功能分析等技术手段，系统研究了Zeb2在视网膜星形胶质细胞发育及视网膜血管生成中的作用及其分子机制。所有动物实验均使用C57BL/6背景小鼠，并获得了中山大学中山眼科中心实验动物伦理委员会的批准。

研究结果主要包括以下几个方面：
**2.1 Zeb2在视网膜APCs和分化中星形胶质细胞中的瞬时表达**。研究人员通过免疫荧光染色发现，在小鼠胚胎期，Zeb2在APCs开始定植视网膜后短暂表达，随后在出生后（P0）随着血管长入和氧合水平升高而下调。在OIR模型中，视神经头（optic nerve head, ONH）周围的星形胶质细胞在缺氧损伤后重新表达Zeb2，表明Zeb2的表达受氧浓度调控。
**2.2 星形胶质细胞特异性Zeb2敲除增强视网膜星形胶质细胞的增殖、迁移和成熟**。Zeb2CKO小鼠表现出发育迟缓和早亡，但其眼球和视网膜结构基本正常。在视网膜发育早期（E17.5和P0），Zeb2CKO视网膜中APCs的增殖和迁移能力显著增强。在P4时，Zeb2CKO视网膜周边区域的星形胶质细胞GFAP⁺/Pax2⁺面积比增高，提示其成熟加速。
**2.3 星形胶质细胞Zeb2敲除导致视网膜浅表血管过度生长**。在发育早期（P4和P6），Zeb2CKO视网膜的血管密度、径向生长以及动脉和静脉的数量及分支均显著增加。然而，这种血管过度生长的表型在P12时恢复正常，表明Zeb2主要调控早期而非晚期的血管生成。
**2.4 星形胶质细胞Zeb2敲除引起血管生成和星形胶质细胞生成相关基因的表达改变**。RNA-seq分析显示，在E17.5 Zeb2CKO视网膜中，多种促血管生成基因（如Vegfa, Sox18）和星形胶质细胞相关基因（如Pax2）上调，而抑制星形胶质细胞增殖的基因（如Cdkn1b, Cyp1b1）下调。ChIP和双荧光素酶实验证实，Zeb2能直接结合并抑制Vegfa基因的启动子活性。
**2.5 Zeb2可被缺氧诱导并促进病理性星形胶质细胞激活**。在OIR模型中，Zeb2在ONH周围星形胶质细胞中被重新诱导。Zeb2的缺失导致缺氧损伤后（P14和P17），无血管区（avascular area, AVA）和新生血管区（neovascular area, NVA）中Pax2⁺星形胶质细胞数量异常增多，表明其病理性激活增强。
**2.6 Zeb2调控缺氧损伤后视网膜星形胶质细胞的分化**。在OIR条件下，Zeb2CKO视网膜中神经毒性A1型反应性星形胶质细胞的标志物（如C3, Serpina3n）表达显著下调，而神经保护性A2型标志物（如S100a10）无明显变化，提示Zeb2促进A1型星形胶质细胞分化。
**2.7 星形胶质细胞Zeb2敲除减轻缺氧损伤后的视网膜神经炎症**。RNA-seq和qRT-PCR分析表明，在P17 OIR Zeb2CKO视网膜中，大量与炎症反应、细胞趋化、白细胞介素-1β（IL-1β）产生和Nlrp3炎症小体通路相关的基因（如Nlrp3, Gsdmd, Casp1, Tnf）表达下调，显示神经炎症反应被抑制。
**2.8 星形胶质细胞Zeb2敲除导致缺氧损伤后丛状ECs升高而尖端ECs减少**。分子分析发现，在P17 OIR Zeb2CKO视网膜中，与病理性新生血管形成相关的丛状ECs标志基因上调，而与生理性再血管化相关的尖端ECs标志基因及关键调控基因（如Plxnd1, Nrf2, Fgf2）下调。这解释了其恶化新生血管形成并阻碍修复性再血管化的表型。
**2.9 星形胶质细胞Zeb2敲除促进原代星形胶质细胞的增殖和迁移**。体外实验显示，从Zeb2^fl/fl; GFAP-CreERT2小鼠分离的原代星形胶质细胞在经他莫昔芬诱导敲除Zeb2后，其增殖和迁移能力显著增强，与体内表型一致。

本研究揭示了Zeb2在视网膜血管生成中的核心调控作用及其双重机制。Zeb2作为氧气敏感的转录因子，在发育期视网膜APCs中瞬时表达，通过直接抑制Vegfa等基因表达，限制星形胶质细胞的增殖、迁移和成熟，确保视网膜血管模板网络的精确形成。然而，在缺氧损伤引发的OIR模型中，Zeb2的重新表达对于驱动特定的神经毒性A1型星形胶质细胞反应至关重要。这种反应虽然具有促炎特性，但通过分泌特定的因子（如FGF2、血管生成素等）并抑制如Nlrp3等炎症通路，创造了有利于修复性尖端ECs生长而非病理性丛状ECs形成的微环境。因此，Zeb2通过调控星形胶质细胞的身份和功能，在生理性与病理性血管生成中扮演了看似矛盾但情境依赖的角色。研究结论指出：Zeb2是视网膜星形胶质细胞功能的关键氧气敏感调节因子，在发育期作为“刹车”确保血管网络的适度生长，而在病理期则作为“协调者”驱动一种必要的星形胶质细胞反应以平衡修复与病理性新生血管。这些发现为针对神经血管疾病的治疗策略提供了新的靶点和思路。