《Peptides》：Endothelin-1 modulates hippocampal and hypothalamic neuronal network activity in mouse primary dissociated cultures and brain slices
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莱娅·韦格曼（Lea Wegmann）|莫里斯·海德（Morris Haid）|丹尼斯·托马森（Dennis Thomassen）|奥尔加·A·谢尔盖耶娃（Olga A. Sergeeva）德国杜塞尔多夫海因里希·海涅大学医学院及附属医院神经与感觉生理学研究所，40225杜塞尔多
莱娅·韦格曼（Lea Wegmann）|莫里斯·海德（Morris Haid）|丹尼斯·托马森（Dennis Thomassen）|奥尔加·A·谢尔盖耶娃（Olga A. Sergeeva）
德国杜塞尔多夫海因里希·海涅大学医学院及附属医院神经与感觉生理学研究所，40225杜塞尔多夫，德国
摘要
内皮素-1（ET-1）不仅是一种血管收缩剂，也是一种神经调节剂。它可以重置生物钟，我们假设它还能调节组胺能神经元（HN）的兴奋性和神经网络活动。组胺能神经元位于下丘脑尾部的结节乳头核（TMN）中，在清醒状态下会自发放电并促进觉醒。先前的研究表明，ET-1可以降低海马锥体神经元的放电频率，但其对组胺能神经元电生理特性的影响尚不清楚。本研究通过单细胞RT-PCR和qPCR技术检测了海马（HPC）和下丘脑尾部（cHPT）中ET受体的表达情况。利用膜片钳记录技术研究了ET-1对HNP和齿状回颗粒细胞（DGgc）的反应，并通过微电极阵列（MEA）对cHPT和HPC的原代培养细胞进行了研究。
ET-1显著降低了HPC中的放电频率，同时增加了cHPT培养细胞中的放电频率，并抑制了HPC中某些MEA通道的活性，同时增强了cHPT中的神经元兴奋性。cHPT中的神经元同步性和爆发性放电显著增强。与HPC相比，cHPT中ETB受体的表达水平更高。在脑切片中，ET-1使HNP的放电频率延迟增加，而DGgc的放电频率降低。HNP中15个神经元中有15个表达ETB受体，15个ETB阳性神经元中有4个表达ETA受体；而在DGgc中，只有50%的神经元表达ETB受体。
我们得出结论，ET-1对cHPT和HPC的作用存在差异。通过兴奋HNP并同步cHPT中的神经网络活动，ET-1可能参与了觉醒和清醒状态的细胞及电路层面的调节机制。
引言
内皮素-1（ET-1）是一种由21个氨基酸组成的肽，能与G蛋白偶联的ET受体（ETA和ETB）结合。1988年，柳泽（Yanagisawa）及其同事首次将其描述为一种由血管内皮细胞合成的强效血管收缩剂[1]，此后几十年间，包括神经科学家在内的多个领域的科学家持续关注其研究[2]，发现ET-1及其受体存在于大脑中，并在处理压力、疼痛和焦虑的神经回路中起调节作用[3, 4, 5]。ETA和ETB是治疗肺动脉高压等疾病的药物靶点，双受体拮抗剂波生坦（bosentan）于2001年成为首个获批的ET受体靶向药物[2]。最近使用下一代配体的临床试验探索了该靶点在治疗缺血性中风等神经系统疾病方面的潜力，进一步推动了人们对ET-1在大脑中作用机制的研究[6]。
已知ET-1参与生物钟的调节[7]，其在多种组织中的表达具有昼夜节律，且在清醒状态下达到峰值[8]。此外，ET-1还被认为具有同步生物钟的功能[9, 10]。这表明ET-1可能参与觉醒调节的神经回路。位于下丘脑尾部的结节乳头核（TMN）中的组胺能神经元（HN）在清醒状态下会自发放电，在慢波睡眠期间则处于静息状态[11]。这些神经元投射到大脑的多个区域，整合来自其他上行网状激活系统（ARAS）神经元的输入，从而调整行为以适应环境变化[11]。HN对多种能够稳定觉醒状态的肽类物质敏感，如食欲素[12]、促甲状腺激素释放激素（TRH）[13]和P物质[14]。然而，ET-1对HN的电生理特性及其受体表达的影响仍不清楚。
在下丘脑中观察到ET-1及其受体和内皮素转化酶1（ECE-1）的表达[15, 16]，后者可将“大内皮素-1”分解为具有生物活性的ET-1[17]，这暗示ET-1可能具有神经递质的功能。关于ET-1对脑神经元影响的研究有限，许多研究报道了这种肽或ET受体激动剂对神经元活动的双向作用[18, 19]。一些电生理研究中还存在血管收缩和组织运动的干扰效应[20]。在少数研究ET-1作用的研究中，不同脑区的神经元活动表现出增加[21, 22]、减少[3, 4]或无变化[23]的情况。在海马区，ET-1通过抑制长时程增强（LTP）的诱导并促进异突触长时程抑制（LTD）的诱导来影响突触可塑性[24]。在海马CA1区的锥体神经元中，ET-1主要表达，其受体也较多[3]，因此选择海马作为研究ET-1对TMN中HN影响的参考区域。
鉴于ET-1的昼夜节律作用及其在下丘脑中的表达，我们推测ET-1会影响组胺能神经元的电生理特性以及与觉醒调节相关的神经网络活动。
为了研究ET-1的作用，我们使用膜片钳记录技术研究了小鼠脑切片中的HNP和齿状回颗粒细胞（DGgc），并利用微电极阵列（MEA）记录技术研究了海马（HPC）和下丘脑尾部（cHPT）培养细胞的电生理反应。同时通过单细胞RT-PCR和qPCR技术检测了HNP和DGgc中的ET受体表达情况。
章节摘录
实验动物
实验中使用了C57BL/6基因背景的幼年和成年雌雄小鼠。具体使用了表达荧光蛋白Tomato（由组氨酸脱羧酶启动子Tmt-HDC控制）的小鼠、其亲本系（HDC-Cre和Rosa26-lox-STOP-lox-Tomato (Tmt)）以及其他Cre系小鼠。实验动物生活在无特定病原体的环境中，可自由获取水和食物。实验采用12/12的明暗周期。
ET-1通过ET受体信号通路差异性地调节海马和下丘脑培养细胞的放电频率
我们首先研究了ET-1对HPC和cHPT原代培养细胞的全局影响。ET-1处理后，HPC中所有MEA电极记录到的总放电频率显著降低（配对t检验，t(8)=5.22，p=0.0008），而cHPC中的放电频率则增加（配对t检验，t(11)=2.57，p=0.026）（见图1A、B）。在ET-1处理后的最初1分钟内，这种效应最为明显。
讨论
本研究的主要发现是：ET-1可诱导切片中组胺能神经元（HN）的放电频率延迟增加，并增强培养在MEA上的下丘脑神经元的放电频率、同步性和爆发性放电。双内皮素受体拮抗剂波生坦抑制了ET-1引起的HN放电频率延迟增加。这与先前的研究结果一致[3]，表明海马网络主要受到ET-1的影响。
资助
本研究未获得公共部门、商业机构或非营利组织的任何特定资助。开放获取资源的获取和组织由Projekt DEAL负责。
CRediT作者贡献声明
丹尼斯·托马森（Dennis Thomassen）：负责撰写、审稿与编辑、方法论设计、概念构思。奥尔加·A·谢尔盖耶娃（Olga A. Sergeeva）：负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、项目监督、资源管理、方法论设计、实验实施、数据分析、概念构思。莱娅·韦格曼（Lea Wegmann）：负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法论设计、实验实施、数据分析、概念构思。莫里斯·海德（Morris Haid）：负责撰写、审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明以下可能构成利益冲突的财务关系/个人情况：由于奥尔加·A·谢尔盖耶娃担任副主编，她未参与本文的同行评审过程，也无权访问相关评审信息。本文的编辑工作完全由另一位期刊编辑负责。如果还有其他作者，他们声明自己没有已知的利益冲突。
致谢
我们感谢托马斯·贝彻（Thomas Becher）和斯特凡·谢茨（Stephan Sch?tz）在实验设备和计算机技术方面提供的出色支持，以及赫尔穆特·L·哈斯（Helmut L. Haas）教授对稿件的宝贵意见和建议。
由于奥尔加·A·谢尔盖耶娃担任副主编，她未参与本文的同行评审过程，也无权访问相关评审信息。本文的编辑工作完全由另一位期刊编辑负责。
