整合性的MeRIP-seq和RNA-seq分析揭示了HSV-2感染期间m6A介导的宿主-病毒相互作用的表观遗传调控机制

《Virology》：Integrative MeRIP-seq and RNA-seq Analysis Reveals m6A-Mediated Epigenetic Regulation of Host–Virus Interactions during HSV-2 Infection

　　

Jixiong Li|Di Lin|Jiaxin Xie|Zhidan Zhang|Ying Qian|Siqi Xu|Jingwen Xu|Yunzhang Hu|Jiandong Shi

中国医学科学院医学生物学研究所、北京协和医学院昆明国家昆明高级生物安全灵长类动物研究中心

摘要

单纯疱疹病毒2型（HSV-2）是一种广泛存在的病原体，可导致生殖器疱疹，其特征是具有神经亲和性以及能够建立终生潜伏感染。N6-甲基腺苷（m⁶A）是一种普遍存在的表转录组修饰，它在调节RNA代谢和基因表达中起着关键作用。在这项研究中，我们使用甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）和RNA测序（RNA-seq）技术，分析了感染HSV-2的人类包皮成纤维细胞（HFF-1）中的m⁶A修饰和转录组变化。我们发现了9,477个共同的m⁶A位点和15,842个差异甲基化位点，这些位点主要位于编码序列中。通过对MeRIP-seq数据中HSV-2基因转录本上的m⁶A修饰位点进行分析，共鉴定出63个病毒基因上的145个m⁶A位点。功能富集分析显示，差异m⁶A修饰的基因参与了关键的生物过程，包括基因表达、神经信号传导和免疫反应。通路分析显示，NOD样受体信号通路、Rap1信号通路、内吞作用和粘附连接通路显著富集。RNA-seq分析鉴定了6,172个差异表达基因，其中3,181个上调，2,991个下调。两个数据集的整合分析表明，同时具有m⁶A甲基化改变和差异表达的基因在TNF信号通路和NOD样受体通路等通路中显著富集。这项研究首次全面揭示了HSV-2感染期间m⁶A表转录组修饰及其与转录组重编程的关联，为病毒-宿主相互作用的表观遗传机制提供了新的见解。

引言

单纯疱疹病毒（HSV）属于疱疹病毒科，是全球范围内最普遍的病毒病原体之一（Cole, 2020）。在已知的九种人类疱疹病毒中，HSV-1和HSV-2由于具有广泛的宿主亲和性而被广泛研究，它们可以感染所有年龄段的个体，包括新生儿、青少年和成人（Liu & Zhou, 2007）。HSV-2具有双链DNA基因组，包含74个基因，这些基因编码大约84种对病毒组装、感染、复制和潜伏期建立至关重要的蛋白质（Rajcani et al., 2004）。HSV-2的主要致病特征包括上皮细胞感染、神经侵袭以及建立终生潜伏感染的能力（Ames et al., 2021; Patil & Shukla, 2022; Whitley & Roizman, 2001）。在自然宿主体内，HSV-2主要通过亲密的生殖器接触传播，导致持续感染（Johnston & Corey, 2016）。根据世界卫生组织报告，2015年约有4.91亿14-49岁的人感染了HSV-2，全球生殖器疱疹的患病率约为12%（Abdo et al., 2022; Disease et al., 2016; McQuillan et al., 2018）。到2020年，全球15-49岁人群中新增了2560万例感染病例，使总感染人数达到5.195亿，患病率升至13.3%（Harfouche et al., 2025）。HSV-2发病率的增加凸显了其作为重大公共卫生问题的持续重要性。

RNA会经历多种化学修饰，其中N6-甲基腺苷（m⁶A）是真核mRNA中最常见的内部修饰，它在调节基因表达中起着关键作用。这种修饰涉及腺苷残基第六个氮原子的甲基化，由METTL3–METTL14甲基转移酶复合体催化（Bokar et al., 1997; Desrosiers et al., 1974; Perry et al., 1975; Wei et al., 1976）。相反，去甲基化酶FTO和ALKBH5可去除m⁶A标记，从而动态调节其沉积（Mauer et al., 2019）。m⁶A修饰的功能结果由一系列读取蛋白解释，例如含有YTH结构域的蛋白（包括YTHDF1/2/3和YTHDC1/2）（Patil et al., 2018），这些蛋白识别m⁶A位点并影响RNA代谢、稳定性和翻译效率，从而参与表观遗传调控。m⁶A修饰在进化上是保守的，主要发生在RRACH共识序列中（R = 纯碱基；A = m⁶A；H = A、C或U），存在于数千种mRNA中（Wang & Zhao, 2016）。此外，m⁶A的沉积并非随机分布；它表现出明显的区域富集，大多数位点聚集在转录本的3′末端，尤其是在3′非翻译区（UTRs）和长内含子中，多项研究支持这一点（Ke et al., 2015），这突显了m⁶A在RNA上的序列和结构特异性。

m⁶A甲基化在RNA病毒和DNA病毒引起的感染中的多方面作用受到了越来越多的关注，并在许多研究中得到了强调（Courtney et al., 2019; Gokhale et al., 2016; Gonzales-van Horn & Sarnow, 2017; Hesser et al., 2018; Imam et al., 2020; Kane & Beemon, 1985; Kennedy et al., 2016; Kim et al., 2022; Kim & Siddiqui, 2021; Tan & Gao, 2018）。m⁶A RNA甲基化作为一种复杂的调控机制，精细调节病毒感染过程并影响病毒-宿主相互作用的结局。通过在病毒RNA基因组和转录本上添加m⁶A标记，这种修饰直接影响病毒RNA的稳定性和翻译效率。这些观察结果使我们推测HSV-2可能通过其自身RNA的m⁶A修饰与宿主进行类似相互作用。

作为一种全球普遍存在的DNA病毒，HSV-2采用复杂策略来逃避免疫反应并建立潜伏感染。此外，先前的临床报告表明，HSV-2血清阳性患者感染HIV的风险显著高于HSV-2血清阴性个体（Pierce et al., 2023）。尽管存在这些关联，但HSV-2利用m⁶A修饰来调节宿主-病毒相互作用的潜力尚未得到探索。在本研究中，我们使用甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）和RNA测序（RNA-seq）高通量测序技术，分析了HSV-2感染后HFF-1细胞中的mRNA m⁶A修饰，旨在阐明m⁶A甲基化在HSV-2感染机制中的功能意义。

章节片段

细胞培养、病毒和样本制备

人类包皮成纤维细胞（HFF-1）来自OriCell Biotechnology公司。HSV-2 G株（ATCC: VR-3393）在Vero细胞中培养，经过三次冻融循环后，以4,000 rpm的速度离心10分钟（4 °C）。上清液分装并储存在-80 °C，用于后续感染实验。HFF-1细胞在添加了20%胎牛血清的Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM，Vivacell，目录号C3113-0500）中维持生长

HSV-2感染HFF-1细胞的样本特征

人类包皮成纤维细胞（HFF-1）是HSV-2感染的易感宿主细胞。了解m⁶A修饰如何影响这些细胞中的病毒生命周期和病毒-宿主相互作用非常重要。为此，我们首先在HFF-1细胞中建立了MOI为0.1的HSV-2感染模型。感染后0、6、12和24小时（hpi）记录了细胞病变效应，24小时时病变明显（图1A）。对HSV-2糖蛋白B进行了Western blot分析

讨论

我们的研究表明，HSV-2感染显著改变了宿主细胞的m⁶A表转录组和转录组。通过可逆的RNA化学修饰进行的表观遗传调控在病毒生命周期中起着关键作用。越来越多的证据表明，m⁶A修饰与病毒遗传过程密切相关。例如，m⁶A修饰已被确定为尼帕病毒复制的关键调节因子，其中METTL3的过表达可增强病毒复制（Luo

CRediT作者贡献声明

Jiandong Shi：撰写——审稿与编辑、资源管理、方法学设计、概念构思。Jiaxin Xie：软件使用、正式数据分析、数据管理。Zhidan Zhang：资源管理、方法学设计、正式数据分析。Jixiong Li：撰写——初稿撰写、验证、软件使用、方法学设计、实验研究、正式数据分析、数据管理。Di Lin：验证、软件使用、实验研究、数据管理。Jingwen Xu：软件使用、资源管理、方法学设计。Yunzhang Hu：监督、资源管理。Ying Qian：

数据可用性声明

本研究生成和分析的数据集可在GEO数据库中找到，访问号为GSE317005。数据集的直接链接是https://www.ncbi.nlm.nih.gov/GSE317005。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

资金来源

本研究得到了云南省自然科学基金（202401AS070048、202401BC070008、202501AT070148）、国家自然科学基金（82572030）、云南省科技重大项目（202502AA310008）以及云南省卫生健康委员会的高端医疗人才培训计划（L-2024019）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。