NF1与SPRED1/2通过非RAS-MAPK依赖性功能协同作用

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：NF1 and SPRED1/2 cooperate through RAS-MAPK-independent functions

　　

神经纤维蛋白（neurofibromin）是Ⅰ型神经纤维瘤病基因（NF1）的蛋白产物，其负向调控RAS-MAPK通路需要与SPRED发生直接结合相互作用。尽管神经纤维蛋白中促进RAS内在GTP酶活性的区域仅占整个蛋白的一小部分，但NF1的大量结构域及其相应机制功能迄今仍不明确。研究人员在本研究中表明，NF1与SPRED1/2协同控制了一类RAS非依赖性的生化与信号功能。研究人员利用CRISPR-Cas9方法，在同基因背景的“RASless”小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）系中敲除NF1或SPRED1/2；这些细胞表达KRAS4b野生型变体或致癌性KRAS突变体。结果显示，SPRED1/2缺失可表型模拟（phenocopy）NF1缺失，且二者协同作用是调节MAPK-AKT信号所必需的。此外，NF1或SPRED1/2缺失还导致RAS家族GTP酶RRAS和RRAS2受到强烈抑制，这一过程独立于RAS或AKT通路激活而发生。对NF1或SPRED1/2敲除MEF细胞进行转录组微阵列（microarray）分析后，揭示出一组特异性的RAS非依赖性、NF1–SPRED1/2依赖性基因特征；而这些相同基因也直接受神经纤维蛋白RAS-GTP酶功能的调控。来源于Ⅰ型神经纤维瘤病患者的Schwann细胞模型进一步证实了NF1–SPRED1/2下游效应分子的调控，这些模型包括丛状神经纤维瘤细胞以及NF1或神经纤维蛋白RAS-GAP活性被消除的未受累神经细胞。综上，本研究提出了依赖NF1与SPRED1/2协同作用、且与经典MAPK信号相解耦的RAS非依赖性功能。

该论文发表于《Proceedings of the National Academy of Sciences》，聚焦于Ⅰ型神经纤维瘤病基因NF1编码产物神经纤维蛋白（neurofibromin）的非经典功能。既往研究已明确，神经纤维蛋白作为RAS GTP酶激活蛋白（RAS-GAP，促进RAS水解GTP的负调控蛋白），通过其GAP相关结构域（GRD）抑制经典RAS-MAPK信号通路，而SPRED蛋白家族，尤其是SPRED1与SPRED2，则通过与神经纤维蛋白结合并促进其膜定位来共同完成这一抑制过程。由于神经纤维蛋白中直接介导RAS调控的GRD仅占整蛋白很小一部分，而NF1患者致病突变广泛分布于GRD之外的多个区域，因此长期以来学界推测，神经纤维蛋白可能还具有超越经典RAS调控之外的附加功能。与此同时，NF1缺失与SPRED缺失分别导致神经纤维瘤病和Legius综合征，两类疾病均被归入RASopathy，提示二者协作的异常具有重要病理意义。然而，NF1/SPRED复合体是否存在独立于经典RAS-MAPK轴的调控输出，以及这些输出是否与疾病发生相关，仍缺乏直接证据。基于这一科学问题，研究人员开展了系统研究。

为尽量排除经典RAS同工型的补偿效应及RAS持续激活带来的间接干扰，研究人员构建并使用了同基因背景“RASless”小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）模型，仅保留单一KRAS4b野生型或致癌型KRAS^G12C、KRAS^G12D等位基因，并借助CRISPR-Cas9分别敲除NF1或SPRED1/2，从而区分NF1–SPRED1/2复合体介导的RAS依赖性与RAS非依赖性效应。研究最终证明：SPRED1/2缺失可在多个层面表型模拟NF1缺失；NF1与SPRED1/2除共同负调控经典RAS-MAPK信号外，还协同调控一组独立于经典RAS-MAPK增强激活的下游转录输出与GTP酶变化。尤为重要的是，这些非经典输出并非源自神经纤维蛋白未知的附加功能，而是至少部分直接依赖其RAS-GAP活性。研究由此揭示，NF1–SPRED复合体不仅是经典RAS抑制模块，还是调控非经典信号输出的重要节点，这一发现对理解NF1相关疾病与Legius综合征的分子基础具有重要意义。

在技术方法方面，研究人员主要采用以下策略：首先，在来源明确的同基因背景“RASless” MEF细胞中，利用CRISPR-Cas9构建NF1敲除、SPRED1/2双敲除以及NF1精氨酸指（arginine finger）位点敲入突变模型；其次，应用RAS-GTP pull-down、免疫印迹（Western blot）与磷酸化信号检测评估RAS、MAPK、AKT及相关GTP酶状态；再次，采用Clariom? D转录组微阵列分析筛选差异表达基因；最后，在ATCC来源的NF1患者未受累外周神经Schwann细胞与丛状神经纤维瘤Schwann细胞，以及NF1缺失黑色素瘤细胞中进行交叉验证，以增强结论的稳健性。

研究结果部分包含多个层次，依次界定了NF1与SPRED1/2在经典与非经典信号中的协同作用。

Loss of NF1 or SPRED1/2 Leads to Elevated RAS Activity.
该部分首先验证NF1或SPRED1/2缺失对经典RAS活化的影响。研究人员在仅表达KRAS4b野生型、KRAS^G12C或KRAS^G12D的MEF细胞中敲除NF1或SPRED1/2，并通过Raf-RBD pull-down检测RAS-GTP水平。结果显示，在KRAS4b野生型背景下，NF1缺失显著升高RAS-GTP水平，SPRED1/2缺失同样造成RAS-GTP增加，但程度低于NF1缺失；而在KRAS^G12C或KRAS^G12D背景下，NF1缺失并未进一步显著提高RAS-GTP水平。该结果说明，NF1与SPRED1/2的确共同抑制经典RAS活化，且在致癌性KRAS已经持续活化的背景中，NF1的GAP效应难以进一步体现。由此可见，SPRED1/2缺失在经典RAS调控层面上可表型模拟NF1缺失。

NF1 or SPRED1/2 Loss Is Required for Sustained MAPK and AKT Activation in the Absence of the RAS-Related GTPases, RRAS and RRAS2.
在这一部分，研究人员进一步检测NF1或SPRED1/2缺失对RAS下游信号的影响。结果表明，在KRAS4b野生型MEF中，NF1或SPRED1/2缺失均显著增强MEK1/2和ERK1/2磷酸化，提示MAPK通路被持续激活；同时，AKT及其下游TSC2磷酸化也明显升高。值得注意的是，尽管AKT-TSC2信号增强，但mTORC1下游效应分子p70S6K、S6RP和4E-BP1并未出现相应变化，提示该AKT活化并未简单转化为典型mTORC1输出。更关键的是，研究人员发现，无论是否存在致癌性KRAS突变，NF1缺失均显著降低RRAS与RRAS2的转录和蛋白表达，并减少RRAS-GTP与RRAS2-GTP水平，而MRAS基本不受影响。SPRED1/2缺失则显著抑制RRAS，但对RRAS2影响较弱。由于这些变化并不依赖经典RAS或AKT通路增强，说明NF1与SPRED1/2还共同维持RRAS/RRAS2相关的非经典信号稳态，这构成了本文的重要发现之一。

Ablation of NF1 or SPRED1/2 Downregulates a Subset of Gene Signatures Independent of RAS Activity.
为识别NF1–SPRED1/2介导的RAS非依赖性输出，研究人员进行了Clariom? D转录组微阵列分析。通过比较不同KRAS背景下NF1敲除细胞与对应亲本细胞的表达谱，并整合SPRED1/2缺失模型，研究筛选出一组共同受NF1与SPRED1/2依赖的基因特征。其中一个突出的特征是，多种与上皮—间质转化（EMT）相关的基因在NF1或SPRED1/2缺失后显著下调。随后，研究人员通过免疫印迹及转录水平分析验证了CDH11、COL1A1、IGFBP2、SEMA3C、α-SMA和TAGLN等分子。结果显示，这些基因在NF1缺失或SPRED1/2缺失细胞中普遍显著降低，尤其CDH11、COL1A1、IGFBP2和SEMA3C抑制最为明显。该结果表明，NF1–SPRED1/2复合体维持了一组特定转录输出，而这些输出并不依赖经典RAS-MAPK信号增强。值得强调的是，虽然这些基因常被视作EMT与肿瘤促进相关因子，但在本研究体系中，其表达反而依赖NF1与SPRED1/2存在，提示它们在不同细胞环境中具有情境依赖性功能。

Loss of NF1 or Disruption of Neurofibromin’s RAS-GAP Function in NF1 Patient-Derived Nerve or Plexiform Neurofibroma Cells Corroborates the Suppression of the NF1–SPRED1/2-Dependent Signaling Effectors.
为了确认上述发现并非局限于MEF模型，研究人员进一步在NF1患者来源的Schwann细胞模型中开展验证。与未受累外周神经细胞相比，丛状神经纤维瘤细胞表现出AKT、PRAS40和TSC2磷酸化升高，部分细胞还表现为4E-BP1磷酸化增加。同时，这些患者来源细胞中RRAS、CDH11、IGFBP2和α-SMA均显著下降，部分细胞中RRAS2、COL1A1和TAGLN也受到明显抑制。类似趋势亦在NF1缺失黑色素瘤细胞中获得支持。接着，研究人员构建了NF1精氨酸指位点突变，即鼠源NF1^R1278P和人源NF1^R1276P模型。该突变不破坏神经纤维蛋白结构、表达水平或其与RAS结合能力，但可选择性消除RAS-GAP活性。结果显示，在MEF和患者来源神经细胞中，NF1精氨酸指突变可再现NF1缺失对RRAS、CDH11及部分下游分子的抑制效应。虽然不同模型中受影响分子的范围并不完全一致，但整体证据明确表明，NF1–SPRED1/2依赖性下游基因特征至少部分由神经纤维蛋白的RAS-GAP活性直接介导，而非来自蛋白其他尚未界定的独立功能。

讨论部分进一步整合了这些结果。研究指出，在仅表达致癌型KRAS^G12C或KRAS^G12D的细胞中，NF1缺失不再进一步提升RAS-GTP或MAPK活性，说明这些突变型KRAS对神经纤维蛋白GAP作用具有耐受性；相对地，在KRAS4b野生型背景中，NF1或SPRED1/2缺失则明显提升RAS-MAPK信号。与此同时，虽然AKT与TSC2磷酸化增加，但经典mTORC1输出未同步增强，提示NF1–SPRED1/2可能通过非经典AKT机制发挥作用。更重要的是，研究通过转录组和多模型验证，确认NF1与SPRED1/2共同维持一组EMT相关基因和RRAS/RRAS2表达，这些效应独立于经典RAS-MAPK活化，并且至少部分依赖神经纤维蛋白的RAS-GAP功能。研究还指出，其他p120 RAS-GAP家族成员如Rasa1或Rasa2的敲低并不影响这些下游效应，进一步支持这一调控具有神经纤维蛋白特异性。

研究结论部分可译为：这些数据共同表明，NF1与SPRED1/2协同调控一组独特的EMT相关基因特征，该过程独立于经典RAS蛋白GTP装载增强及MAPK通路激活。研究人员提出，神经纤维蛋白可能作为某种尚未明确GTP酶的GAP，该GTP酶的功能调控这一组可能参与EMT或其他尚待表征替代信号机制的基因表达。上述附加非RAS功能在多大程度上促成NF1表型，仍有待未来研究深入阐明。总之，本研究鉴定出一组RAS非依赖性、NF1依赖性蛋白，可望作为NF1和Legius综合征治疗中新型生物标志物与分子靶点。