《Frontiers in Immunology》：A multidisciplinary RNA-guided approach to complement genomic analysis of unsolved patients with an inborn error of immunity
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摘要：引言：先天性免疫缺陷（Inborn Errors of Immunity, IEI）是一组异质性强且不断扩大的疾病，涉及超过500个基因的550余种疾患。目前IEI的基因诊断率为15–70%，未确诊病例常归因于意义未明变异（Variant of Unce
摘要：引言：先天性免疫缺陷（Inborn Errors of Immunity, IEI）是一组异质性强且不断扩大的疾病，涉及超过500个基因的550余种疾患。目前IEI的基因诊断率为15–70%，未确诊病例常归因于意义未明变异（Variant of Uncertain Significance, VUS）缺乏再分类证据及现有方法无法检出的变异。为克服上述局限，研究人员开发了一种结构化RNA引导（RNA-guided）方法，对未确诊IEI患者进行重新分析以提高基因检测的诊断率。方法：由多学科团队协作，对22例临床疑似IEI但标准遗传学检测无结论的患者进行系统分析，基于异常表达（expression outlier）、异常剪接（splicing outlier）及杂合单核苷酸变异（Single Nucleotide Variant, SNV）处的等位基因特异性读段计数检测单等位基因表达（mono-allelic expression），寻找符合临床表型与预期遗传模式的潜在致病变异。结果：在一名男性患者中检出IKBKG（NM_001099857.5: c.671+2T>G）剪切位变异导致外显子5跳跃；在一名女性患者中发现X连锁隐性基因CYBB（NM_000397.4: c.45+5G>A）剪切变异合并X染色体失活偏斜致功能转录本显著减少；在一名符合NFKB1单倍剂量不足表型的患者中检出深层内含子变异（NM_003998.4: c.1495+506T>C）激活隐蔽剪接位点引入假外显子。结论：最终为22例患者中的2例（另有1例为潜在致病）提供确定诊断，表明RNA引导变异解读可提升IEI的基因诊断率。随着解读技术进步，将RNA测序（RNA-Sequencing, RNA-seq）整合入常规诊断是实现IEI更全面精准遗传诊断的关键步骤。
论文解读：RNA引导方法补充未确诊先天性免疫缺陷患者基因组分析的研究
《Frontiers in Immunology》刊发的此项研究针对先天性免疫缺陷（Inborn Error of Immunity, IEI）经标准外显子组测序（Whole Exome Sequencing, ES/WES）无法确诊的临床疑难病例，探讨外周血全血（Whole Blood, WB）RNA测序（RNA-Sequencing, RNA-seq）联合异常表达、异常剪接及单等位基因表达（mono-allelic expression, MAE）分析在辅助分子诊断中的价值。目前IEI基因诊断率仅为15–70%，约20–50%检出的变异被归类为意义未明变异（Variant of Uncertain Significance, VUS），且位于非编码区或导致剪接改变的致病变异常被外显子捕获遗漏。IEI相关基因约90%在全血中可检测到足够表达量，因此研究人员假设RNA-seq能揭示DNA水平无法判定的功能影响，从而提升诊断率。本研究由临床免疫科、临床遗传学及生物信息学专家组成多学科团队（Multidisciplinary Team, MDT），对22例经临床ES及IEI基因包分析无结论、但临床高度怀疑单基因IEI的患者采集PAXgene管全血进行RNA-seq，结合重新注释的ES数据，采用OUTRIDER检测基因表达异常（expression outlier）、FRASER检测剪接连接使用异常（splicing outlier）、DROP中tMAE模块检测杂合SNV处等位基因特异性读段计数判定单等位基因表达，并与背景样本及GTEx（Genotype-Tissue Expression）外部计数合并校正批次效应，经MDT综合表型—变异—遗传模式进行解读。
主要关键技术方法：
研究人员纳入荷兰格罗宁根大学医学中心（University Medical Center Groningen, UMCG）2022年6月至2025年9月收治的22例临床疑诊单基因IEI且ES/IEI基因包未见确诊发现的患者（11男/11女，年龄3个月～61岁），同时收集21例内部背景患者及300例外周血GTEx v6计数文件扩充对照队列。DNA来源于全血，ES采用Agilent SureSelect XT Human All Exon V7文库及NovaSeq 6000测序，原始VCF使用MOLGENIS Variant Interpretation Pipeline（VIP, v7.9.1）重新注释（含SpliceAI、GREEN-DB、ClinVar、VKGL、CAPICE及gnomAD注释）。RNA取自PAXgene管，Qiagen Fast Select去除rRNA/globin mRNA，Illumina NovaSeq 6000平台测序（正向/反向链文库混合），STAR（v2.7.9a）比对GRCh37参考基因组（GENCODE v29）。表达异常用OUTRIDER（v1.20.1），剪接异常用FRASER（v1.99.4），单等位基因表达用DROP中tMAE（v1.0.0）模块分析；显著阈值为校正后P值＜0.05。部分多异常基因案例辅以基因网络辅助诊断优化工具（Gene Network Assisted Diagnostic Optimization, GADO）联用人类表型本体（Human Phenotype Ontology, HPO）术语进行无偏倚基因优先级排序。最终由MDT评估RNA异常基因是否匹配临床表型、含可解释变异及符合孟德尔遗传模式。
研究结果
Patient cohort（患者队列）：
22例未确诊IEI患者入组，其中4例曾接受利妥昔单抗（rituximab，抗CD20单抗）治疗致B细胞耗竭，研究人员在解读其RNA数据时考虑细胞组成改变的影响。每例患者同步行免疫分型。
Identification of candidate variants（候选变异鉴定）：
每例患者IEI基因中位检出表达异常基因1个、剪接异常基因3个，中位48个IEI基因含单等位基因表达杂合SNV。8例在RNA-seq中检出IEI基因的异常表达或异常剪接且该基因存在DNA水平可解释变异。经家系及文献评估，3例判定为潜在致病变异（potentially causal variant），5例为不确定（inconclusive），其余14例RNA无异常或异常基因无DNA变异归为不确定。
Case 1: IKBKG
研究人员在一3月龄男婴（全身自身炎症、小叶性脂膜炎、周期性发热、肝脾肿大等）ES阴性病例中，通过FRASER发现IKBKG剪接异常（校正P＝7.93×10?7），约30%读段出现外显子5跳跃；DNA水平检出经典剪接供体位点变异NM_001099857.5: c.671+2T>G（chrX:153,788,776），桑格测序证实为de novo且具约40–50%体细胞嵌合。外显子5缺失致NEMO蛋白缺失外显子5编码区，损害TLR3/RIG-I样受体Ⅰ型干扰素应答，符合NEMO-deleted exon 5 autoinflammatory syndrome表型，判定为潜在致病变异。
Case 2: CYBB
一名20岁女性（拟诊幼年型系统性红斑狼疮及克罗恩病），其父确诊X连锁隐性慢性肉芽肿病（Chronic Granulomatous Disease, CGD）并携带CYBB剪切变异NM_000397.4: c.45+5G>A。患者RNA-seq示CYBB表达显著降低（OUTRIDER校正P＝2.87×10?15），tMAE检测到邻近杂合SNV严重等位基因偏斜表达，提示X染色体失活偏斜（skewed X-inactivation）；ES检出相同杂合剪切变异，VIP标注为可能致病（likely pathogenic）。功能验证显示中性粒细胞氧化爆发（oxidative burst）仅10–11%正常，X失活甲基化分析示87–88%母源X染色体失活，符合女性X连锁CGD携带者因X失活偏斜发病机制，判定为潜在致病变异。
Case 3: NFKB1
一名42岁女性（常见变异型免疫缺陷/Common Variable Immunodeficiency, CVID、淋巴结肿大、免疫性血小板减少性紫癜、间质性肺病，CD21lowB细胞升高），RNA-seq发现NFKB1剪接异常（校正P＝0.032），11%读段在外显子14–15间插入假外显子（pseudo-exon），ES未覆盖该区域但RNA检出深层内含子杂合变异NM_003998.4: c.1495+506T>C（chr4:103,517,995），桑格验证其来自母源。NFKB1功能缺失（Loss-of-Function, LOF）致单倍剂量不足为已知致病机制，假外显子引入提前终止密码子可诱发无义介导衰变（Nonsense-Mediated Decay, NMD），但因无症状母亲携带同一变异，暂归为VUS待功能验证，文中仍列为潜在致病变异。
讨论与结论（总结翻译）：
本研究证明RNA引导方法可补充传统DNA诊断，在22例未确诊IEI中明确3例潜在致病变异（诊断率13.6%），与既往Mendelian疾病RNA-seq研究4–14%增量相符。RNA-seq的价值体现在四方面：①通过异常表达/剪接解释DNA VUS（IKBKG例，克服假基因干扰）；②评估X连锁病女性携带者X失活偏斜（CYBB例）；③提示ES未覆盖深层内含子/非编码致病变异并锁定候选基因（NFKB1例）；④可为常隐性疾病寻找第二致病变异提供线索。19例未确诊者中部分可能因第二变异位于非编码区（需全基因组测序Genome Sequencing, GS辅助）、细胞类型特异性转录本低丰度、治疗致免疫细胞组成改变或批次效应残留。合并不同建库方向RNA数据经OUTRIDER/FRASER自编码器校正后仍可有效检出生物学相关异常。研究者认为将RNA-seq整合入IEI常规诊断流程并结合GS、长读长/单细胞测序及基因共表达网络工具（如GADO、Borzoi），有望进一步提高疑难IEI的分子确诊率并指导靶向治疗或造血干细胞移植（Hematopoietic Stem Cell Transplantation, HSCT）决策。最终结论：RNA引导变异解读可提高IEI未确诊患者的基因诊断率；随着解读技术进展，将RNA-seq纳入常规诊断是实现IEI更全面精准遗传诊断的关键步骤。
