《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Early nervous system development in the chaetognath Spadella cephaloptera exhibits conserved bilaterian patterning features
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神经系统在结构和组织上展现出广泛的多样性，然而，一套广泛保守的信号通路组分和转录因子持续与许多动物谱系的早期神经发生相关联。确定这些保守的标志物如何映射到系统发育上具有信息量但未被充分研究的谱系（尤其是螺旋动物门）中神经发生区域的时空组织，对于精炼关于神经系统
神经系统在结构和组织上展现出广泛的多样性，然而，一套广泛保守的信号通路组分和转录因子持续与许多动物谱系的早期神经发生相关联。确定这些保守的标志物如何映射到系统发育上具有信息量但未被充分研究的谱系（尤其是螺旋动物门）中神经发生区域的时空组织，对于精炼关于神经系统进化起源和多样化推论至关重要。毛颚动物是一个常被发现与有颌动物门（Gnathifera）关系密切的螺旋动物门谱系，其拥有一个紧凑且集中的神经系统，但缺乏早期神经发育的详细分子描述。在此，研究人员通过结合基于细胞核染色的解剖学分期以及从原肠胚形成到早期胚后阶段与早期神经发生和轴向模式化相关的保守发育基因的时空分析，生成了毛颚动物Spadella cephaloptera早期神经发生基于表达的发育图谱。Sce-soxB1-like1和Sce-neuroD的表达在原肠胚形成期间标记了一个侧向的神经外胚层（neuroectoderm，NEC）区域。值得注意的是，Sce-neuroD在一个广泛的外胚层区域早期被激活，并在有丝分裂活跃的神经外胚层细胞内表达，这与在增殖性神经发生区域早期部署的特征一致。Sce-soxB1和Sce-soxB2相对于Sce-soxB1-like1显示出延迟和更局限的空间表达，这表明在毛颚动物神经发生过程中，SoxB基因的旁系同源基因（paralog）存在特定的分工。Sce-bmp2/4和Sce-chd在原肠胚形成期间表现出相互拮抗的背腹表达模式，这与早期神经发生区域的形成相吻合，随后在发育后期转变为更局部的表达。Sce-nk6和Sce-hb9揭示了发育中的腹侧神经中心（ventral nerve center，VNC）早期腹侧区域化特征，其中Sce-hb9占据一个更广泛的Sce-nk6区域的子集，这与保守的与腹侧亚型相关的区域化模式一致。Sce-th（酪氨酸羟化酶，tyrosine hydroxylase）在刚孵化幼体VNC的一小部分双侧细胞中被检测到，而Sce-dbh（多巴胺β-羟化酶，dopamine beta-hydroxylase）仅在早期幼体的前部VNC和头部区域首次被检测到，这表明儿茶酚胺通路组分的部署具有阶段依赖性和区域特异性。综上所述，这些基于表达的数据集为毛颚动物的早期神经发生提供了比较参考，并为评估螺旋动物门内早期神经发生模式化的保守和谱系特异性特征提供了一个框架。
神经系统在组织上展现出非凡的多样性，从刺胞动物的基底上皮神经网到许多双侧对称动物（Bilateria）高度集中的脑和神经索。尽管存在这种结构分化，比较发育研究一致鉴定出一套与早期神经发育相关的共享信号通路和转录因子库。在充分研究的模型系统中，信号通路（如骨形态发生蛋白/脊索蛋白（BMP/Chordin）信号通路）与神经发生区域的定位相关，而转录因子，最显著的是Sox家族和碱性螺旋-环-螺旋（basic helix–loop–helix，bHLH）家族成员，被广泛认为参与神经特化（neural competence）、模式化（patterning）和神经元分化。这些组分在远缘类群中的反复参与表明，早期神经发生涉及高度保守的分子特征。然而，基因表达上的相似性是否对应于跨谱系早期神经发生事件的可比空间组织仍不清楚。在传统模式生物之外扩展分子研究已开始完善这一图景。保守的神经相关转录因子在主要的双侧对称动物分支中广泛报道，包括无肠动物（acoels）、蜕皮动物（ecdysozoans）、后口动物（deuterostomes）和螺旋动物（spiralians）。在螺旋动物门内，对环节动物、软体动物和纽形动物的研究表明，这些基因中的许多在早期神经发生期间表达，但它们的时序、空间关系和细胞环境在不同类群间存在差异，有时甚至在近缘物种之间也是如此。这种变化强调，共享的分子标志物可以与神经发育不同的时空配置相关联。然而，现有的螺旋动物发育数据仍严重偏向冠轮动物（lophotrochozoan）模型类群，而来自有颌动物门（Gnathifera，一个与冠轮动物亚门为姐妹群的主要螺旋动物分支）的可比数据则很少。这种不均匀的分类取样限制了对从冠轮动物模型推断出的模式在多大程度上可以推广到整个螺旋动物门的评估，从而限制了对双侧对称体神经发生保守特征的更广泛推断。此外，区分神经进化中的深层同源性（deep homology）与趋同性（convergence）最终需要密集的比较取样，而来自未充分研究的螺旋动物谱系的基于表达的图谱提供了一个必要的基线。
毛颚动物（箭虫）是海洋无脊椎动物，基于最近的系统基因组学分析，常被发现与有颌动物门关系密切。成体神经系统具有紧凑、不分节的组织，一个前脑神经节通过围食道神经连接器与躯干内的表皮内腹侧神经中心相连。经典的胚胎学研究已经描述了毛颚动物神经发育的关键解剖特征，包括两层的原肠胚组织以及VNC的外胚层起源。在底栖毛颚动物Spadella cephaloptera中，组织学观察显示，在原肠胚形成期间侧外胚层增厚，随后外胚层细胞核分裂并向内迁移形成VNC的神经节细胞团。在伸长期间，类似的侧头部外胚层增厚产生了脑神经节，而躯干神经节细胞则完全与覆盖的外胚层分离。随后使用免疫组织化学方法的工作表征了神经元亚型，并记录了胚后发育过程中神经结构的逐步成熟。然而，毛颚动物早期神经发生的分子基础，包括持续与不同谱系早期神经系统发育相关基因的时空部署，在很大程度上尚未探索，限制了与其他螺旋动物的直接比较。
在本研究中，研究人员通过整合基于细胞核染色的解剖学表征与广泛保守的神经相关基因（包括SoxB/bHLH因子，如soxB1和neuroD；背腹模式化基因bmp2/4和chordin；以及早期亚型相关标志物nk6和hb9）的时空分析，提供了毛颚动物S. cephaloptera早期神经发生基于表达的发育图谱。通过追踪从原肠胚形成到早期胚后阶段的基因表达动态，研究人员勾勒出该谱系中早期神经发生事件的空间和时间组织。这些数据共同为评估这些与神经系统发育相关的标志物在螺旋动物门内的部署提供了一个独立的比较参考。
样本收集与保存、候选基因鉴定与直系同源性评估、全封片荧光原位杂交（FISH）与成像等方法详见原文。简要来说，成体S. cephaloptera采自法国罗斯科夫的潮间带，并在维也纳大学维持。胚胎和胚后阶段（刚孵化幼体和早期幼体）使用4%多聚甲醛（PFA）固定。候选基因的推定同源物通过blastx比对从S. cephaloptera的初步转录组中鉴定。通过IQ-TREE v2进行最大似然（ML）系统发育分析以评估直系同源性。基因表达检测主要使用杂交链反应（HCR-FISH），对于Sce-dbh和Sce-th则使用传统的染色/荧光原位杂交（ISH）方法。所有探针设计和实验方案细节均参照原文。
研究人员从S. cephaloptera的初步转录组中恢复了soxB1、soxB2、neuroD、bmp2/4、chordin、nk6、hb9、th和dbh的推定单拷贝直系同源物。最大似然系统发育分析确认了它们的身份，每个基因都与相应的双侧对称动物直系同源物聚类。除了Sce-soxB1，研究人员还从转录组中鉴定了两个高度相似的SoxB1-like序列。Sce-soxB1-like1与Tubulanus polymorphus的Sox2-like最相似，而Sce-soxB1-like2与Trichuris trichiura的Sox2匹配。这两个序列在ML系统发育树中形成一个强支持的簇，表明它们是S. cephaloptera中推定的SoxB1-like旁系同源基因。由于soxB1-like1是更长且更完整的转录本，研究人员使用该序列进行HCR探针设计以表征soxB1-like的表达。
S. cephaloptera胚胎腹侧神经系统发育的基于DAPI的解剖学表征揭示了神经发生区域（NEC和发育中VNC的神经细胞）在原肠胚形成到孵化过程中的形态学变化。在早期原肠胚阶段，外胚层包含一个双侧的侧向区域，其细胞核相对较大且DAPI染色较弱，研究人员将其称为推定的神经外胚层（NEC）。到中期原肠胚，NEC在形态学上可识别，其腹外侧外胚层的细胞核显示出明显的大小异质性，包括大的、DAPI染色较弱的细胞（LNE细胞）和小的、DAPI染色较强、呈泪滴/卵圆形的细胞（SNE细胞）。在晚原肠胚阶段，SNE细胞似乎向基部迁移，填充内中胚层的腹外侧边缘。在早期伸长阶段，内部的SNE细胞层增厚并汇聚形成新生的VNC。这些形态学观察为后续基因表达分析提供了位置框架。
SoxB旁系同源基因和neuroD的表达分析显示，Sce-soxB1在晚原肠胚阶段首次被检测到，表达为双侧纵向条带，主要位于内部的SNE细胞带内。在早期伸长阶段，Sce-soxB1在新生的外侧体细胞簇的一个细胞亚群中表达。在刚孵化幼体中，Sce-soxB1在眼睛、未来口部周围的细胞亚群以及外侧体细胞簇中表达。Sce-soxB2在刚孵化幼体中被检测到，在推定的腹前头部神经节原基、未来口部周围的细胞、推定的口周表皮和外侧体细胞簇中表达。Sce-soxB1-like1和Sce-neuroD的双标记分析表明，在早期原肠胚，Sce-soxB1-like1在推定的神经外胚层区域形成广泛的侧向域，而Sce-neuroD在该区域中心部分的小双侧中侧斑块中表达。到晚原肠胚，Sce-neuroD在整个NEC以及覆盖其上的外胚层斑块中持续活跃，而Sce-soxB1-like1主要局限于腹侧的LNE细胞。在早期伸长阶段，两者在新生的外侧体细胞簇和头部芽体中显示出广泛的重叠。
Sce-bmp2/4和Sce-chd的双标记分析显示，在早期原肠胚，Sce-bmp2/4在背侧外胚层表达，而Sce-chd占据一个跨越侧外胚层并延伸至腹侧的广泛区域。Sce-neuroD表达位于Sce-chd阳性的侧外胚层内，包括推定的神经外胚层区域。随着原肠胚形成继续，这些背腹表达区域变得更窄。在晚原肠胚，Sce-bmp2/4持续存在于背侧外胚层，而Sce-chd表达主要限制在腹侧外胚层。这种相互拮抗的背腹表达模式在原肠胚形成期间与早期神经发生区域的出现相吻合，表明存在一个背腹极化的BMP信号环境。
Sce-nk6和Sce-hb9的表达模式分析揭示了腹侧神经亚型相关的早期区域化。在晚原肠胚阶段，Sce-nk6在腹侧SNE细胞区域广泛检测到。在早期伸长阶段，Sce-nk6和Sce-hb9共同标记发育中的VNC，呈现出部分重叠的表达域。在刚孵化幼体中，Sce-hb9在推定的腹前头部神经节原基、口周表皮、外侧体细胞簇和肠道中表达，而Sce-nk6在头部、中间腹侧体细胞簇、躯干表皮和躯干-尾部边界附近的细胞中检测到。在外侧体细胞簇内，Sce-hb9占据腹侧和中部的大部分区域，而Sce-nk6表达涵盖一个更广泛的区域，包括缺乏可检测Sce-hb9表达的背侧区域。这种重叠的Sce-nk6+/Sce-hb9+组织符合保守的腹侧中枢神经系统模式化方案。
Sce-th和Sce-dbh的表达模式分析显示了儿茶酚胺通路组分的胚后部署。在刚孵化幼体中，Sce-th在外侧体细胞簇前部的一小部分双侧神经元中表达。Sce-dbh在刚孵化幼体中未被检测到。在早期幼体中，Sce-dbh出现在外侧体细胞簇前部的三对双侧细胞和前部口部的细胞中。这表明儿茶酚胺相关分子组分在早期胚后发育中是顺序激活的。
综上所述，研究人员的分析表明，S. cephaloptera的神经系统发育依赖于保守的双侧对称体分子程序，这些程序以谱系特异的时空模式部署。Sce-soxB和Sce-neuroD表达勾勒出一个神经外胚层区域，其中增殖和分化相关程序重叠，而一个瞬态的Sce-bmp2/4 - Sce-chordin背腹模式与早期神经发生区域的出现相吻合。腹侧神经亚型模式化，包括由Sce-nk6和Sce-hb9标记的早期运动神经元规格化，进一步支持了毛颚动物中核心双侧对称体神经模式化机制的保守性。相反，Sce-th的局限表达和Sce-dbh的延迟出现表明，儿茶酚胺能通路组分是在已建立的神经区域内逐步组装的，而非作为一个统一的单胺能系统。这些发现共同定义了毛颚动物早期神经发生的时空组织，并为未来分析与双侧对称体神经发生相关的标志物在螺旋动物门内的部署提供了一个比较参考。
