《Frontiers in Behavioral Neuroscience》：Sexually dimorphic effects of single prolonged stress on conditioned suppression behavior in Long Evans rats with no detection of altered mRNA expression of VGLUT1, GAD1, and Arc in the ventral hippocampus
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摘要：引言：女性尤其易患创伤后应激障碍(PTSD)等应激相关疾病，但大多数临床前研究集中于雄性。啮齿类动物在恐惧行为中常表现性别二态性应对策略，使神经生物学解释复杂化。为便于比较，本研究采用操作性条件性压制(paradigm)，其恐惧测量不依赖于应对策略，评估
摘要：引言：女性尤其易患创伤后应激障碍(PTSD)等应激相关疾病，但大多数临床前研究集中于雄性。啮齿类动物在恐惧行为中常表现性别二态性应对策略，使神经生物学解释复杂化。为便于比较，本研究采用操作性条件性压制(paradigm)，其恐惧测量不依赖于应对策略，评估单次延长应激(Single Prolonged Stress, SPS)对恐惧行为的影响。由于应激与兴奋性表型相关，检测了腹侧海马(vHip)——一个应激敏感脑区——中囊泡谷氨酸转运体1(vesicular glutamate transporter 1, VGLUT1)和谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase, GAD1) mRNA以评估兴奋性与抑制性相关标志物，并采用活动调节细胞骨架相关蛋白(Activity-regulated cytoskeleton associated protein, Arc/Arg3.1)鉴定恐惧消退期间激活的神经元。本研究旨在确定SPS是否在条件性压制恐惧行为中产生性别差异及伴随的vHip分子变化。方法：32只成年Long Evans大鼠(雌雄各n=16)训练在变间隔(variable-interval, VI)程序下压杆获取蔗糖，稳定反应后部分(每性别n=8)接受SPS。所有大鼠接受5次条件刺激(conditioned stimulus, CS)—电击配对恐惧条件化，消退期含基线VI-60反应及CS呈现，恐惧定义为CS期间压杆抑制。最后 sessions 后取含vHip组织进行RNA原位杂交(RNA in situ hybridization, RNA-ISH)检测VGLUT1、GAD1及Arc mRNA。结果：SPS损害雄性第1天消退但对雌性无影响；第2天无论SPS与否雄性恐惧高于雌性；第3天及回忆session无显著效应。实验条件下vHip VGLUT1、GAD1或Arc mRNA无性别或应激显著效应。讨论：结果证明SPS对条件性压制测量的恐惧消退具性别特异性效应，未来应探索更早时间点、其他区域(如杏仁核、内侧前额叶皮层)、激素调节及可能缓解SPS效应的干预措施。
该研究论文发表于《Frontiers in Behavioral Neuroscience》。目前创伤后应激障碍（PTSD）女性发病率约为男性两倍，而PTSD核心特征之一是恐惧消退（fear extinction）受损，即无法更新已习得的威胁关联。临床前研究多采用僵住（freezing）行为量化恐惧，但雌雄鼠存在性别二态性应对（如雌鼠更多出现突奔darting），导致神经回路层面的真实性别差异被行为测量偏差掩盖。单次延长应激（Single Prolonged Stress, SPS）是公认的PTSD啮齿类模型，可诱导雄鼠恐惧消退缺陷，但SPS对雌鼠及在不受运动策略干扰的恐惧测量范式中的性别差异尚不明确。此外，应激可扰动海马兴奋/抑制（E/I）平衡（囊泡谷氨酸转运体1 VGLUT1上调、谷氨酸脱羧酶GAD1下调），腹侧海马（ventral hippocampus, vHip）参与恐惧调控且与SPS效应相关，但其分子水平变化是否伴随条件性压制（conditioned suppression）范式下的行为性别差异仍有待阐明。研究人员采用操作性条件性压制范式——将恐惧操作定义为CS期间压杆取食行为的抑制，该指标不依赖运动性应对策略——对Long Evans大鼠施加SPS，考察雌雄鼠恐惧消退行为的差异，并在vHip检测兴奋性（VGLUT1 / Slc17a7）、抑制性（GAD1）标志物及即刻早期基因Arc（Activity-regulated cytoskeleton associated protein / Arg3.1）的mRNA表达，以探寻行为表型背后的分子基础。
主要关键技术方法
研究人员选用32只成年Long Evans大鼠（雌雄各16只，Envigo），单笼饲养，食物限制至自由摄食体重95％保留蔗糖奖赏动机，在 operant chambers 完成FR1→VI-15→VI-30→VI-60压杆训练。随机分组建模：SPS组依次接受2 h束缚＋15 min强迫群泳（24℃水2/3满）＋乙醚暴露至翻正反射消失，对照组同环境无处理，恢复1周。所有大鼠接受5次CS（9 kHz纯音＋闪灯光，30 s）与足底电击（雄性0.50 mA、雌性0.45 mA，0.5 s）配对的条件化，随后连续3 d extinction session（含VI-60基线＋5次无US的CS），再隔48 h做消退回忆。恐惧以抑制比（suppression ratio＝(A?B)/(A+B)，A为CS前30 s压杆数、B为CS期间压杆数）量化。行为结束后取脑，冰冻切片，用RNAscope multiplex v2 进行VGLUT1（Slc17a7）、GAD1、Arc 三通道RNA原位杂交（RNA in situ hybridization, RNA-ISH），Olympus IX83采集，QuPath做细胞分割与荧光强度定量，线性混合效应模型统计分析；行为数据以two-way / repeated measures ANOVA及估计边际均值（estimated marginal means, EMMs）比较。
研究结果
SPS暴露或性别对SPS后基线VI-60程序下蔗糖按压反应无影响
SPS前后雌雄鼠VI-60压杆数无显著差异，两因素ANOVA显示性别、SPS及交互均无主效应（p＞0.05），提示SPS未损害一般操作性取食动机；条件化后24 h VI-60 session亦无组间差异，排除情境性压杆抑制。
SPS显著损害雄性第1天恐惧消退，雌性无此效应
第1天消退two-way ANOVA示性别主效应显著（F(1,28)=8.47, p=0.007），性别×SPS交互显著（F(1,28)=4.40, p=0.045）。EMMs比较：雄性SPS组抑制比（EMM=0.967, SE=0.085）显著高于雄性对照组（EMM=0.682, SE=0.085; t(28)=-2.37, p=0.025），表明SPS损害雄鼠第1天消退（更高恐惧）；雌性SPS组（EMM=0.541）与雌性对照组（EMM=0.613）无差异（p=0.557）。
第2天雄性较雌性表现出消退受损，与SPS无关
第2天仅性别主效应显著（F(1,28)=4.77, p=0.037），雄性平均抑制比（M=0.60, SE=0.11）高于雌性（M=0.33, SE=0.06），SPS主效应及交互均不显著（p＞0.05），说明此日雌雄固有恐惧水平差异显现，SPS急性效应未持续。
第3天消退及消退回忆日性别与SPS均无影响
第3天及消退回忆session（extinction recall session）two-way ANOVA显示性别、SPS及交互均不显著（all p＞0.05），表明到第3天各组均完成消退，SPS诱导的行为分离仅见于消退首日。
性别与SPS对vHip中VGLUT1、GAD1及Arc mRNA表达无显著检测效应
线性混合效应模型（随机截距按个体ID）显示VGLUT1、GAD1、Arc均无性别主效应、SPS主效应或性别×SPS交互（all p＞0.05）。VGLUT1+细胞约占ROI神经元65.13％，GAD1+约34.87％。虽有雌性SPS组VGLUT1稍高、雌性Arc略高的趋势，但置信区间重叠大，未达显著性。研究人员指出组织采自最终回忆session后行为差异已消弭的时间点，可能为分子阴性结果原因之一，且样本有效量受限。
讨论与结论翻译
本研究表明，采用不依赖运动性应对策略的条件性压制范式检测到SPS对恐惧消退具性别二态性效应——SPS损害雄性而非雌性大鼠第1天恐惧消退，此雄性特异性损伤并非行为策略差异的人为产物，可能反映神经生物学分歧；第2天雄性整体较雌性维持更高恐惧，SPS效应未延续；第3天及回忆session无组间差异。vHip中VGLUT1、GAD1及Arc mRNA在此实验条件下未检出显著性别或SPS效应，提示分子采样需匹配行为最大分离的时间窗及扩展至其他脑区（如杏仁核、内侧前额叶皮层mPFC）。综上，SPS在条件性压制恐惧消退范式中对雄性产生选择性消退损害，强调将性别作为生物变量及超越僵住行为测量的重要性；未来研究应探讨更早分子取材时间点、附加脑区、激素调节及潜在干预手段。
