内源性大麻素系统调控强直性GABA抑制的可塑性

《Journal of Physiology》：The endogenous cannabinoid system gates plasticity of tonic GABA inhibition

　　

GABA能神经传递产生两种抑制形式：由突触GABAA受体瞬时激活所决定的相位性抑制（phasic inhibition），可引发抑制性突触后电流；以及由胞外"环境"GABA持续激活突触外GABAA受体所引起的强直性抑制（tonic inhibition）。GABA能传递效能的改变是促成脑功能经验依赖性修饰的重要机制。突触GABA能效能改变背后的机制已被广泛研究，其中内源性大麻素（endocannabinoid，eCB）依赖的GABA能突触可塑性是特征较为明确的机制。然而，eCB信号对突触外GABA张力（GABA tone）的潜在调控尚不清楚。研究人员通过全细胞膜片钳记录发现，皮层锥体神经元短暂去极化伴随强直性GABA抑制作用的一过性增强，该增强依赖于CB1受体活性和eCB动员。此外，这种去极化依赖的强直性抑制可塑性并非源于胞外GABA浓度的一过性升高，而是需要细胞内神经类固醇合成，因为药理学抑制负责神经类固醇级联合成的P450scc酶可阻断此现象。这些数据证明，在持续神经元活动下，eCB和神经类固醇被募集来精细调节活化神经元中的强直性突触外GABA能抑制。

论文解读：《The endogenous cannabinoid system gates plasticity of tonic GABA inhibition》发表于《Journal of Physiology》

一、研究背景与立题依据

GABA能抑制除经典的相位性（phasic）突触传递外，还存在由低浓度胞外环境GABA持续激活突触外GABA_AR（extrasynaptic GABA_Areceptors）所产生的强直性（tonic）抑制，其在认知、感觉处理、应激反应及情绪行为中发挥重要作用，异常时常涉及癫痫、抑郁及成瘾等病理状态。eCB（endocannabinoid，内源性大麻素）介导的突触GABA传递可塑性已有深入研究——eCB经后突触合成、激活突触前CB1受体引起短时或长时Depolarization-Induced Suppression of Inhibition（DSI，去极化诱导的抑制减弱）。然而，eCB系统是否及如何调控突触外GABA张力（tonic GABA inhibition）几乎未被探讨。本研究旨在明确短暂神经元去极化能否诱发强直性GABA抑制的可塑性及其分子机制。

二、主要技术方法

研究人员取2–3月龄C57BL/6J小鼠（雌雄均用），制备300 μm厚体感皮层（Somatosensory Cortex, SI）冠状脑切片，在持续灌流人工脑脊液（ACSF）下进行全细胞电压钳记录，钳制于?70 mV，选用含高浓度CsCl的电极内液以使GABA_AR介导电流内向。基础强直性电流（I_tonic）通过GABA_AR拮抗剂荷包牡丹碱（bicuculline, BIC, 20 μM）或加巴嗪（gabazine/SR-95531, GBZ, 100 μM）灌流前后静息电流（holding current, I_hold）的高斯拟合差值获得；去极化诱导的强直性GABA电流组分（I_GABAPD）通过比较去极化步阶前后ΔI_hold在BIC/GBZ施加前后的差值计算。去极化方案为膜电位由?70 mV钳至0 mV持续5 s以模拟持续神经元活动。药理学干预包括CB1拮抗剂AM251、中性拮抗剂NESS-0327、DAGLα（Diacylglycerol lipase α）抑制剂DO34（阻断2-AG合成）、GAT-1（GABA Transporter-1）抑制剂NO711、神经类固醇合成抑制剂aminoglutethimide（AMG，抑制P450scc）、毒蕈碱受体激动剂carbachol（CCh）及外源神经类固醇allopregnanolone（ALLO）。谷氨酸能传递用AP5和DNQX阻断。数据统计采用配对/非配对t检验、ANOVA及非参数检验等，p<0.05为显著差异。

三、研究结果

Brief depolarisation of cortical pyramidal neurons transiently enhances tonic GABA inhibition

研究人员在SI皮层L2/3锥体神经元记录到BIC敏感的基线强直性电流I_tonic（约6.07±3.73 pA）。给予5 s去极化步阶可诱发经典DSI（sIPSC幅值、频率及电荷转移显著下降），同时伴随I_hold的瞬态下移（ΔI_hold），该下移在BIC存在时显著减小但不完全消失，表明去极化诱发了GABA_AR介导的强直性抑制一过性增强（I_GABAPD≈?20.52±15.46 pA/pF），且该增强可逆。

Depolarisation-induced enhancement of tonic GABA inhibition is sex independent

分别统计雄性与雌性小鼠来源的神经元，基础I_tonic及去极化诱发的I_GABAPD均无性别差异（p=0.704及p=0.305），后续实验合并两性数据。

Depolarisation-induced potentiation of tonic GABA inhibition is eCB dependent

基础条件下CB1拮抗剂AM251或DAGL抑制剂DO34不影响I_tonic，说明无组成性eCB紧张性调控基础强直抑制。但DO34（而非AM251组达显著性，因组间变异大）显著减小去极化诱发的I_GABAPD（p=0.012 vs ACSF），表明2-AG合成是去极化诱导GABA张力增强所必需的。

CB1 receptor activation contributes to the depolarisation-induced potentiation of tonic GABAergic inhibition

为克服组间变异，采用同一细胞前后对照：AM251灌入后I_GABAPD显著衰减（p=0.017）。另用中性CB1拮抗剂NESS-0327进行组间比较亦显示I_GABAPD显著降低（p=0.032）。证实CB1受体激活参与此可塑性。

Boosting 2-AG synthesis increases depolarisation-induced potentiation of tonic GABA inhibition

CCh（促进2-AG合成）本身不影响I_tonic，但显著增大I_GABAPD（p=0.027 vs ACSF）；DO34+CCh共处理则消除CCh的增强效应且低于ACSF对照组，确认eCB（特别是2-AG）动员驱动此可塑性。

Enhancing ambient GABA by inhibiting its reuptake does not occlude depolarisation-induced potentiation of tonic GABA inhibition

GAT-1抑制剂NO711提高基础I_tonic趋势但未影响去极化诱发的I_GABAPD（p=0.290），排除GABA溢出/胞外GABA浓度瞬时升高为此可塑性的机制。

GABA supplementation increases depolarisation-induced potentiation of tonic GABA inhibition

外源加入2 μM GABA增大基础I_tonic且无受体脱敏；在同一细胞中，GABA存在下去极化诱发的I_GABAPD反而进一步增大（p=0.048），不但不被饱和/掩盖（occlude），反而协同增强，再次否定"胞外GABA浓度瞬时升高是原因"的假说。

Inhibition of neurosteroid biosynthesis prevents depolarisation-induced increase of tonic GABA inhibition

P450scc抑制剂AMG无论浴槽给药或仅通过记录电极（胞内）给药，均不改变基础I_tonic，但显著阻断去极化诱发的I_GABAPD（浴槽p<0.001，胞内p=0.039），证明此可塑性需要神经元内de novo神经类固醇合成。

Gabazine confirms the eCB?dependent GABAergic component of I_GABAPD without revealing basal tonic inhibition

100 μM GBZ在基础状态下未检出明显I_tonic（区别于BIC敏感电流可能含BIC敏感K⁺通道成分），但GBZ同样显著衰减去极化ΔI_hold（p<0.001），DO34预处理下GBZ敏感I_GABAPD也被抑制（p=0.004），验证去极化诱导的保持电流变化确为GABA_AR介导且受eCB门控。

The neurosteroid ALLO contributes to extrasynaptic GABA_Areceptor activation

外源ALLO（allopregnanolone, 1 μM）引起内向强直性电流并使GBZ在基础条件下可检出I_tonic，证明突触外GABA_AR对神经类固醇敏感且常态下环境GABA不足激活之。ALLO不能进一步增大去极化I_GABAPD（p=0.503），提示去极化已最大招募内源性神经类固醇敏感组分（occlusion）。

四、讨论与结论总结（翻译浓缩）

研究表明小鼠新皮层中存在一种由神经元去极化触发的强直性GABA抑制可塑性，需要eCB（主要是2-AG）动员及CB1受体激活。经典eCB功能是经突触前CB1引起突触GABA释放抑制（DSI），而本研究发现去极化诱发eCB还可经CB1依赖方式一过性增强突触外GABA抑制。此增强非因胞外GABA浓度改变，而要求de novo神经类固醇合成——P450scc抑制（胞内或浴槽）阻断该可塑性，且含δ亚基的突触外GABA_AR可能是主要介导者。外源ALLO可模拟并饱和该效应。eCB可能通过激活后突触胞体树突或线粒体CB1受体触发神经元内神经类固醇合成（自分泌），或经突触前/星形胶质细胞CB1触发旁分泌神经类固醇释放作用于后突触。2-AG还可能具CB1非依赖的直接GABA_AR调制作用或部分经AEA（anandamide）贡献。此eCB–神经类固醇耦联提供了快速可逆调整锥体细胞抑制张力的机制，可限制过度兴奋、参与皮层集群募集及感觉信息处理的增益控制。

研究结论： 皮层锥体神经元短暂去极化通过内源性大麻素（主要为2-AG）动员及CB1受体激活，触发细胞内神经类固醇de novo合成，从而瞬时可逆地增强突触外GABA_A受体介导的强直性抑制；该可塑性不依赖胞外GABA浓度变化，代表eCB系统除经典突触抑制调控外的新功能——门控强直性GABA抑制的可塑性。