基于膜的生物分离技术在合成生物学下游加工中的应用：pH与热预处理对酵母细胞超滤膜污染及小分子药物传输的影响

《Journal of Membrane Science》：Ultrafiltration of yeast cells – the effects of pH and thermal stress on membrane fouling and biomolecule transmission

　　

本研究探讨了热与碱预处理对交叉流超滤（UF）处理酵母细胞澄清、蛋白清除以及从全细胞生物转化反应中回收两种小分子药物化合物的影响。流式细胞术（flow cytometry）分析显示，未处理的酵母细胞在超滤过程中发生了广泛的细胞破裂，导致渗透通量严重下降，并降低了两种生物碱——奥匹伐酮（oripavine，297 Da）和去甲奥匹伐酮（nororipavine，283 Da）的传输率。然而，在过滤前将酵母细胞暴露于pH 12或80^oC的温度下，可显著减少超滤过程中的细胞破裂，表明其对剪切应力的抵抗力增强。在体积浓缩因子（VCF）为1.5时，任一种预处理均使超滤通量相对于未处理培养液提高了约三倍。显微镜观察发现，未处理培养液形成的膜污染层由破裂细胞构成，结构致密，导致蛋白完全被截留。相比之下，pH 12处理形成了一个由双层完整细胞构成的污染层，蛋白截留率略低（98.1 ± 0.6%）。热预处理导致了最低的蛋白截留率（87 ± 2%）。两种生物碱的传输呈现相似的趋势，其中未处理培养液的传输率最低。两种生物碱之间未表现出选择性。这些热或碱预处理还增加了酵母细胞的通透性，分别导致9%或22%的碱基在细胞内积累。尽管这些预处理增强了超滤通量和碱基传输，但细胞内药物的积累表明，需要额外的渗滤（diafiltration）步骤来将积累在细胞内的目标产物洗脱出来。

固液分离与药物化合物的提取是许多合成生物学工艺有效开发的关键环节。合成生物学作为一种颠覆性技术，正用于生产药品、营养保健品和生物药物，包括在微生物表达系统（如酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae）中生产治疗性蛋白、次级代谢产物和生物碱。与传统从药用植物中提取治疗性化合物的方法相比，这种方法具有诸多潜在优势，如独立于农业周期、气候变率和地缘政治供应链。此外，复杂的生物合成途径可以被组织起来，使得微生物能在单一细胞底盘内执行多阶段途径的多个步骤，或在同一菌株内产生结构相关的化合物。例如，完整的多酶吗啡喃（morphinan）生物碱途径已在单一酿酒酵母菌株中重建，而模块化的苯丙烷途径则通过简单的尾酶交换，使单一底盘能够生产一系列类黄酮类似物。然而，只有将感兴趣的产物与高效的分离方法相结合，细胞反应生产合成分子才有效。该方法涉及从上游发酵和生物转化过程结束时产生的材料（包括微生物细胞、培养基和代谢产物）中分离目标产物。膜加工，包括切向/交叉流膜过滤，被广泛应用于从合成生物学过程中分离药物化合物。该方法自20世纪80年代以来作为一种替代传统固液分离技术（如沉降、离心、转鼓过滤和死端过滤）的方法，在酵母生物质分离中得到应用，并在食品和饮料行业中被广泛采用。在这些过程中，从悬浮进料流中收获或分离酵母细胞通常是下游加工的初始步骤。用膜过滤替代传统过滤具有多项优势，包括消除硅藻土过滤助剂及其相关废弃物处理、减少产品损失，以及由于过滤后高固体含量而改善操作性。膜过滤已成为许多现代生物药物制造不可或缺的一部分。例如，胰岛素的下游加工通常涉及多达八个基于膜的单元操作，而单克隆抗体纯化则包含至少四个涉及膜的步骤。在某些情况下，药物生产流程可能包含多达10到20个膜步骤，支持广泛的功能，包括宿主细胞去除和蛋白清除、去除工艺相关杂质（如核酸、产物变体和聚集体）以及最终配制。对于生物药物行业未来满足成本目标，膜技术也将至关重要，因为下游加工需要高通量和增强的选择性，以实现超越高表达滴度或更大规模细胞培养所带来的收益。在膜过滤前对细胞进行预处理可能提高酵母产生的合成生物学靶标等药物加工中细胞澄清和化合物分离的效率。当目标产物为胞外产物时，保持酵母细胞完整以实现高效的固液分离并避免因细胞通透化而可能发生的损失是可取的。细胞活力在下游加工中并不关键，在某些情况下，细胞死亡是有益的，因为它可以停止残留的宿主细胞酶活性，否则会降解产物。因此，pH和温度可用于对酿酒酵母施加压力，以改变其细胞特性从而辅助过滤。逐渐升温可能允许酵母细胞适应并改变其细胞膜，同时保持膜完整性。相反，突然的热冲击会破坏细胞膜，导致膜完整性丧失和细胞死亡。热暴露还可引发自溶（autolysis），这是一个酵母细胞进入死亡阶段的过程，其中内源性降解酶（如蛋白酶、核酸酶和水解酶）被激活，导致产生并释放较小的、可溶性产物，包括肽、氨基酸和核苷酸。一旦释放，这些胞内化合物可能对分离产生负面影响，诱导膜污染，引入杂质或使后续提取过程复杂化。虽然已发现与45^oC相比，在60^oC下自溶80小时后蛋白质释放减少30%，可能是由于较高温度下降解酶失活，但酵母悬液热处理对膜过滤的影响尚未有报道。研究假设，将酿酒酵母暴露于高温短时间可能通过防止细胞破裂和抑制自溶，避免细胞间物质的不良释放，从而防止广泛的膜污染。pH是另一个可在工业环境中改变以改变酵母特性并可能通过膜过滤促进药物化合物回收的工艺变量。在碱性pH下，酵母细胞壁的生物物理性质可能因葡聚糖组成的变化以及存在的甘露聚糖和甘露蛋白的水解而改变。碱性也可激活信号通路，导致转录响应和酵母细胞壁组成与组织的进一步变化。这种响应与酸性pH形成对比，后者已知有利于酿酒酵母生长。酿酒酵母的结构完整性预计不会受到碱性环境短期暴露的影响，这从一项研究中得到证实，该研究中酵母细胞在90^oC或108^oC下用0.2 M NaOH处理5分钟，细胞保持完整，尽管细胞壁变得更肿胀和不规则。在高pH下操作对于下游纯化步骤也是可取的，例如布洛芬在纳米过滤中在高pH下被更好地截留，这是由于阴离子药物与带负电的膜之间的排斥作用，从而提高了收率。然而，关于酵母细胞长期暴露于强碱性环境对其细胞壁通透性和结构完整性的影响以及对下游生物加工的影响，信息仍然匮乏。膜过滤期间沉积的酵母滤饼的特性对分离效率和收率至关重要。先前关于酿酒酵母超滤（UF）和微滤（MF）的研究主要集中于最佳膜截留分子量（MWCO）和操作参数，如跨膜压力（TMP）、悬浮介质、细胞浓度和过滤模式。传统的滤饼过滤理论通常用于描述酵母细胞造成的膜污染。根据该理论，稳态渗透通量的阻力可分为两个组成部分：膜阻力和滤饼阻力，后者源于酵母细胞的沉积。最初，酵母细胞沉积在膜表面，但随着通量下降，由于水力驱动力减小，细胞沉积减少，随后较细的颗粒优先沉积。这些沉积物共同形成一个次级或动态膜，作为具有更高比阻力的过滤助剂，保护底层过滤膜免于与大分子（如蛋白质、多糖及其聚集体）直接相互作用。这种动态膜成为控制过滤性能的主要因素，使得超滤（UF）中的通量与微滤（MF）相似甚至更高，同时改善了大分子的截留。因此，过滤膜的名义截留分子量不再决定分离性能。迄今为止，大多数关于动态滤饼形成的研究都集中在包含酵母和模型大分子（如牛血清白蛋白、β-乳球蛋白和肌红蛋白）的二元进料系统。分子量远低于1 kDa的小分子的传输尚未得到系统研究。鉴于许多合成生物学靶标和药物产物是分子量远低于1 kDa的次级代谢产物，理解通过动态酵母滤饼膜的传输对于最大化收率至关重要。此外，不应忽视胞外蛋白的传输，因为它们通过膜会复杂化下游加工，导致后续提取和纯化过程中的操作挑战。本研究探索了使用膜过滤进行酵母细胞澄清和分离小分子药物化合物去甲奥匹伐酮（283 Da），该化合物由奥匹伐酮（297 Da）在一个涉及表达N-去甲基酶（N-demethylase）酵母菌株的全细胞生物转化合成生物学过程中产生。膜分离步骤的目标是允许小的生物活性分子自由渗透以最大化回收率，同时选择性地截留更高分子量的杂质，如蛋白质、其他胶体物质以及细胞碎片。选择30 kDa膜作为折衷方案，其膜孔径足够大以确保对小分子的本征截留可忽略不计，但又足够小以截留大分子污染物。尽管可以考虑中等截留分子量（例如，介于1至30 kDa之间）的膜，但文献证据表明，在复杂进料中的分离性能由过滤期间形成的动态污染层决定，因此底层膜的截留分子量不是决定性因素。本研究考察了酵母细胞经碱性pH和热预处理对超滤过程操作的影响。选择的条件包括发酵后的天然pH 5.5和碱性条件pH 12。选择后一个值是为了远离两种生物碱的pKa值（酚羟基：奥匹伐酮为9.0，去甲奥匹伐酮为8.6；叔胺：奥匹伐酮为7.9，去甲奥匹伐酮为9.3；使用ChemAxon MarvinSketch版本24.1.2预测的值），确保这些化合物保持带电状态并具有最大溶解度。热处理方案——加热至80^oC，随后进行短暂保持（0分钟与30分钟）——旨在使降解酶失活并防止自溶，同时通过逐渐热暴露可能保持细胞完整性。使用扫描电子显微镜（SEM）和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对形成的膜污染层形态进行表征，以评估酵母滤饼特性对过滤的影响，同时流式细胞术也为理解未处理和预处理酵母发酵液超滤过程中发生的污染机制提供了有用的见解。

研究背景聚焦于合成生物学作为生产药物等产品的颠覆性技术，其下游加工中的固液分离是关键。然而，传统的过滤方法存在诸多问题，如使用硅藻土助滤剂带来废物处理负担和产品损失，且在处理高浓度酵母悬浮液时易因细胞破裂和形成致密污染层导致通量下降、小分子产物截留和蛋白去除效率低。因此，亟需开发更高效、选择性的膜分离策略。研究人员开展了一项针对酿酒酵母发酵液中全细胞生物转化产生小分子生物碱（奥匹伐酮和去甲奥匹伐酮）的超滤分离研究，重点考察了pH和热预处理对膜污染、通量、蛋白截留及产物传输的影响。该研究对于优化合成生物学下游加工、提高药物生产收率和效率具有重要意义。论文发表在《Journal of Membrane Science》。

研究人员为开展研究，主要采用了以下关键技术方法：首先，对酿酒酵母发酵液进行预处理，包括在pH 12下碱处理和在80^oC下热处理30分钟，以改变细胞特性和过滤行为。其次，使用交叉流超滤系统（配备30 kDa聚醚砜膜）在不同体积浓缩因子（VCF）下处理预处理前后的发酵液，监测通量、蛋白截留和生物碱传输。第三，综合运用流式细胞术（评估细胞大小、完整性和膜通透性）、扫描电子显微镜（SEM，观察污染层形貌）和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM，三维重构污染层）对细胞状态和膜污染层进行多尺度表征。最后，通过高效液相色谱（HPLC）定量分析生物碱浓度，并用Bradford法测定蛋白含量，评估分离性能。研究的发酵液来源于三批次独立培养的酿酒酵母，其中含有高浓度酵母细胞、胞外蛋白以及目标生物碱。

研究结果表明，预处理显著影响超滤性能。**pH和热应力对发酵液特性的影响**：在无细胞条件下，热处理和碱处理对生物碱的化学降解影响很小；但在有细胞存在时，两种处理均导致胞外生物碱浓度下降，主要归因于细胞通透化后的被动扩散。碱处理还显著增加了胞外蛋白浓度。**热和pH胁迫对细胞大小和膜通透化的影响**：流式细胞术显示，未处理细胞在超滤过程中因泵剪切力而大量破裂并产生碎片。碱处理和热处理（80^oC，30分钟）则立即引起细胞通透化，并使细胞在超滤过程中表现出更强的抗剪切破裂能力，碎片比例较低。**污染膜的异位可视化**：SEM和CLSM证实，未处理发酵液形成由破裂细胞和碎片构成的厚而致密的污染层；碱处理形成较薄的双层完整细胞污染层；热处理形成的污染层厚度中等，含完整细胞和少量碎片。**超滤性能**：在浓缩模式下，预处理（碱处理和热处理）显著提高了渗透通量，达到相同VCF所需时间缩短。蛋白截留率方面，未处理发酵液达到完全截留（100%），碱处理略低（98.1 ± 0.6%），热处理最低（87.3 ± 1.79%），这归因于碱性条件下增强的静电排斥。**生物碱传输**：碱处理条件下生物碱传输率最高（超过100%，部分因细胞内积累），热处理与未处理条件传输率相近。两种生物碱之间未表现出分子量差异带来的选择性。但预处理导致的细胞通透化使得部分生物碱在细胞内积累，需通过渗滤步骤回收。

讨论部分总结了预处理通过改变细胞壁特性和剪切抗性，从而调控滤饼结构，最终影响膜污染程度、通量和分离选择性。碱处理通过增强细胞壁机械强度和静电排斥，形成薄而多孔的滤饼，利于通量和小分子传输，但对蛋白截留略有影响；热处理同样增强细胞抗剪切性，但对蛋白截留影响更大。研究结论指出，进料预处理是优化酿酒酵母发酵液超滤性能的有效策略，能显著改善膜通量和小分子产物回收，但需权衡预处理本身可能造成的细胞内产物损失，并可能需结合渗滤步骤。这些发现为膜分离技术在合成生物学下游加工，特别是小于1 kDa的小分子产物回收中的应用提供了重要见解。