《Neurochemistry International》：Iron overload inhibits neuronal extracellular vesicles secretion via SNARE dysfunction
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王晓婷|李阳|米晓青|杨桐桐|李云|张金杰|贾凤菊|谢俊霞|宋宁青岛大学基础医学院、脑科学与疾病研究所、护理学院，中国青岛266071摘要在多种神经退行性疾病和衰老过程中，观察到大脑中铁的沉积。细胞外囊泡（EVs），包括外泌体，是细胞间通讯的关键介质。最近发现源自神经元的EVs可
王晓婷|李阳|米晓青|杨桐桐|李云|张金杰|贾凤菊|谢俊霞|宋宁
青岛大学基础医学院、脑科学与疾病研究所、护理学院，中国青岛266071
摘要
在多种神经退行性疾病和衰老过程中，观察到大脑中铁的沉积。细胞外囊泡（EVs），包括外泌体，是细胞间通讯的关键介质。最近发现源自神经元的EVs可作为神经系统疾病血浆中的有前景的生物标志物。然而，目前尚不清楚神经元铁过载是否以及如何影响EVs（外泌体）的分泌。在本研究中，我们使用L1细胞粘附分子（L1CAM）标记源自神经元的EVs，并观察到大脑中铁沉积的小鼠血浆中L1CAM阳性囊泡浓度显著降低。在用柠檬酸铁铵处理的PC12细胞中也观察到了铁分泌减少的现象。我们进一步发现，铁过载对外泌体分泌的抑制作用与细胞增殖、外泌体运输途径和溶酶体降解途径无关，可能是通过干扰SNARE复合体的功能实现的。最后，我们观察到随着年龄的增长，小鼠血浆中的源自神经元的EVs数量增加。我们的结果表明，铁过载在体内和体外都抑制了神经元EVs的分泌，这可能是由于SNARE复合体功能障碍所致。
引言
铁是一种必需的微量元素，参与多种代谢过程。在大脑中，它在氧气运输、神经递质合成、髓鞘形成、线粒体能量代谢和细胞增殖中起着关键作用（McCarthy等人，2018；Urrutia等人，2021）。铁也是某些酶的组成部分，主要通过与各种分子伴侣进行电子交换来发挥其功能（Soares & Hamza，2016）。然而，在某些条件下，铁也会产生有害影响。在氧化还原循环过程中，通过Fenton反应会产生高活性的羟基自由基，如果这些自由基不能被有效中和，可能会导致活性氧（ROS）的过度积累（Kosman，2010）。ROS水平升高会损害DNA、蛋白质和脂质（Lambeth & Neish，2014）。因此，维持铁的平衡对正常的脑功能和神经退行性疾病至关重要（Chen等人，2025）。在中枢神经系统中，铁稳态的破坏和异常铁积累与多种神经退行性疾病的发病机制密切相关，如帕金森病（PD）、阿尔茨海默病（AD）、多发性硬化症和亨廷顿病（Ayton等人，2013；Hare & Double，2016；Liu等人，2019；Meyer等人，2015；Weigel等人，2014）。
外泌体是由大多数细胞类型分泌的膜结合的细胞外囊泡（EVs）。早期内体通过质膜的内向出芽形成，是内体运输途径的第一个站点，对于内化货物的初步分类至关重要（Grant & Donaldson，2009；Woodman & Futter，2008）。早期内体的货物会沿着不同的途径移动：可回收的分子被导向外围管状区域并返回质膜或跨高尔基网络，而非可回收的货物则积累在中央液泡区，逐渐发展为晚期内体。在内体成熟过程中，内体膜的内向出芽会形成管腔内囊泡（ILVs），进而形成多囊泡体（MVBs）。这些MVBs要么与溶酶体融合进行降解，要么与质膜融合将ILVs释放到细胞外空间成为外泌体（Hessvik & Llorente，2018；Kowal等人，2014）。外泌体的形成和分泌需要多种蛋白质的协同作用。由于膜运输主要由运输囊泡介导，内体依赖于多种适配蛋白和包被复合体来执行其多种功能。
最初被认为是细胞丢弃不需要的成分的机制，现在外泌体被认为通过在不同细胞间运输脂质、蛋白质和遗传物质而在细胞间通讯中起关键作用（Bang & Thum，2012；Mohammadipoor等人，2023）。在中枢神经系统中，包括神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞在内的多种细胞类型都能分泌外泌体。这些囊泡在维持神经通讯和稳态中起着重要作用，并越来越多地被认为与神经退行性疾病的病理机制有关。值得注意的是，中枢神经系统来源的EVs可以进入外周循环并携带病理蛋白，使其成为神经系统疾病的有前景的生物标志物（L. Jia等人，2019；L. Jia等人，2021；Shi等人，2010）。L1细胞粘附分子（L1CAM）是一种在中枢神经系统中相对富集的神经元细胞外囊泡表面标记物。通过L1CAM从血浆中捕获大脑来源的EVs并分析其组成、数量和大小的变化，可以有效地识别与疾病相关的改变（Z. Guo等人，2024；Z. Yu等人，2020；Z. Yu等人，2024）。迄今为止，尚未报道铁与神经元EVs（外泌体）分泌之间的关系。在本研究中，我们首先建立了大脑铁沉积的小鼠模型，并观察到血浆中的神经元来源的EVs减少。然后我们发现铁过载对外泌体分泌的抑制可能是由于SNARE复合体功能的干扰。最后，我们观察到随着年龄的增长，大脑中铁沉积的小鼠血浆中的神经元来源的EVs数量增加。
章节片段
动物和处理
从中国江苏Gemppharmatech公司获得了8周大的雄性C57BL/6小鼠。所有小鼠均饲养在符合严格管理标准的动物设施中，室温保持在19 ± 2 °C，相对湿度为50 ± 5%，光照/黑暗周期为12小时，可自由获取水和食物。小鼠被随机分配到对照组和FAC组。FAC组通过鼻内给予200 mg/kg的柠檬酸铁铵（FAC）
鼻内给予FAC会导致大脑铁沉积
我们首先建立了鼻内铁给药模型，以研究是否可以观察到大脑铁沉积。三周后，计算了嗅球（OB）、尾状核-壳核（CPu）、外侧苍白球（GPe）、腹侧苍白球（VP）和黑质网状部（SNr）中铁阳性细胞的数量。铁沉积在OB、CPu、GPe和VP中，表现为铁阳性细胞数量的增加，尽管不同区域的差异较大（图1a-e）。
讨论
在本研究中，我们通过鼻内给药建立了大脑铁沉积的小鼠模型。鼻内给药提供了一种非侵入性的方法，可以绕过血脑屏障（BBB），将各种生物制剂输送到中枢神经系统（Formica等人，2022；Huang等人，2024；Y. Wang等人，2024）。鼻内给予FAC（一种铁过载试剂）可以显著地将FAC输送到多个脑区。
CRediT作者贡献声明
李云：验证。贾凤菊：写作 – 审稿与编辑。杨桐桐：验证。米晓青：写作 – 初稿，验证。李阳：验证，数据管理。王晓婷：写作 – 初稿，验证。宋宁：写作 – 审稿与编辑，验证，资源获取，研究经费申请。谢俊霞：监督，资源获取，研究经费申请。张金杰：研究
未引用的参考文献
Grant and Donaldson, 2009; Wang et al., 2024.
数据可用性
所有支持本研究结果的数据均可向相应作者提出合理请求后获得。
伦理批准
本研究遵循《实验动物护理和使用指南》进行，并获得了青岛大学医学院伦理委员会的批准（QDU-AEC 2022116，2022年3月1日）。
资助
本工作得到了国家自然科学基金（资助编号82301787, 32471188, 32170984）的资助。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务或个人关系。
