基于牛津纳米孔测序技术的全基因组测序方法在恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）中的应用，以支持疟疾的分子监测

《Scientific Reports》：Development of an Oxford nanopore sequencing technology-based whole genome sequencing method for Plasmodium falciparum to support malaria molecular surveillance

　　

摘要

全基因组测序（WGS）对于疟疾分子监测（MMS）至关重要。虽然短读长平台已被广泛用于恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）的基因组研究，但在解析该高度复杂基因组中的重复区域和结构变异方面存在局限性。长读长技术，如牛津纳米孔技术（ONT）开发的技术，提供了互补的能力，可能特别适合资源匮乏的环境。我们优化了一种基于ONT的WGS方案，用于从干燥血液斑点（DBS）和全血样本中检测恶性疟原虫。实验室菌株（3D7、HB3和Dd2）与全血混合以创建模拟感染样本，并制备干燥血液斑点。使用Qiagen或Tween-Chelex 100提取DNA，通过McrBC/MspJI消化、NEBNext微生物组DNA富集试剂盒（NMDEK）和选择性全基因组扩增（sWGA）技术富集寄生虫DNA。通过多重qPCR技术定量寄生虫和人类DNA的含量。测序在ONT（R10.4.1流式细胞仪）上进行。该方案通过一项治疗疗效研究的临床样本进行了验证。与Qiagen试剂盒相比，Tween-Chelex 100的DNA产量更高（Ct值差异为2–4），但Qiagen试剂盒获得的读长更长（中位数分别为2791 bp和2252 bp）。NMDEK通过将β-微管蛋白人类基因的Ct值提高约10个循环有效去除了人类DNA，而sWGA则增加了寄生虫DNA的含量。联合富集方法在100 p/μl的浓度下可获取超过75%的寄生虫DNA，并实现超过90%的基因组覆盖度。模拟样本和临床样本的测序结果显示，读长中位数超过2 kb，深度超过30倍，准确率达到99.8%。全血样本在测序深度和覆盖度方面优于干燥血液斑点样本。ONT WGS的结果与Sanger测序高度一致，并检测到了额外的突变和结构变异，包括pfmdr1和pfgch1的拷贝数变异。优化的ONT-WGS方案能够从全血和干燥血液斑点样本中实现准确、高覆盖度的测序，为在疟疾流行地区进行MMS提供了实用的选择，具有相对较快的周转时间和较低的基础设施要求。