《RNA Biology》：Comprehensive profiling and molecular characterization of alternative splicing regulation in synaptic remodeling associated with neuropathic pain induced by chronic constrictive injury in a rat Model
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研究人员利用SUVA流程分析了12个RNA-seq数据集（GSE217932），以鉴定假手术组（Sham）、慢性束缚性损伤（CCI）组以及接受左旋四氢帕马汀（L-Tetrahydropalmatine, L-THP）治疗的CCI组（CCI_THP）中的剪接改变
研究人员利用SUVA流程分析了12个RNA-seq数据集（GSE217932），以鉴定假手术组（Sham）、慢性束缚性损伤（CCI）组以及接受左旋四氢帕马汀（L-Tetrahydropalmatine, L-THP）治疗的CCI组（CCI_THP）中的剪接改变。通过共表达和共扰动分析，定义了剪接相关的RNA结合蛋白（RBPs）网络。关键发现在CCI大鼠模型中通过行为学测试、连接点特异性实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）进行了验证。结果显示三组间存在显著不同的剪接谱。差异剪接基因富集于与轴突发生、细胞连接组装和突触组装相关的通路。包括Lrrc4c、Shank2、Nefh和Grid2在内的几个基因在CCI组表现出异常剪接，且部分被THP治疗所逆转。K-means聚类支持THP在恢复与突触重塑相关的剪接改变中的作用。此外，Nefh的剪接与Rbm47和Grn的表达相关，并且包括Rbm47、Grn、Lcp2、Plek、Ptpn6和Hcls1在内的多个RBPs在CCI组中显著上调。通过体内对选定剪接事件和蛋白变化的验证支持了这些结果。本研究提供了神经性疼痛中可变剪接和RBP失调的转录组全景图谱，并表明THP可能部分通过调节异常剪接程序来缓解神经性疼痛。这些发现为理解神经性疼痛机制提供了见解，并确定了潜在的治疗靶点。
神经性疼痛（Neuropathic Pain, NP）是一种由神经系统损伤引起的慢性疼痛疾病，其发病机制复杂，现有治疗手段疗效有限。研究表明，突触可塑性改变，特别是突触重塑，是神经性疼痛发生和维持的关键病理基础。可变剪接（Alternative Splicing, AS）是增加基因组编码容量的核心转录后调控机制，对神经元功能和突触形成至关重要。虽然可变剪接失调与神经性疼痛的发生有关，但其中由RNA结合蛋白（RNA-Binding Proteins, RBPs）介导的调控机制尚不明确。因此，研究人员旨在全面解析大鼠慢性束缚性损伤（Chronic Constriction Injury, CCI）神经性疼痛模型中，脊髓组织内可变剪接的全景图谱、与突触重塑相关的关键基因剪接改变，以及RBPs在其中的调控网络，并探讨药物左旋四氢帕马汀（L-Tetrahydropalmatine, L-THP）的干预作用与机制。
为了系统揭示上述问题，研究人员首先对来自公共数据库（GEO，编号GSE217932）的CCI大鼠脊髓组织RNA-seq数据进行生物信息学分析。他们利用SUVA（Splicing Unbiased VAriant identification）流程全面鉴定了假手术组（Sham）、CCI模型组（CCI）和L-THP治疗组（CCI_THP）之间的差异剪接事件，并通过共表达和共扰动分析构建了RBPs与差异剪接事件（Regulated Alternative Splicing events, RAS）的调控网络。为验证生物信息学预测结果，研究人员构建了SD大鼠CCI模型，并设置Sham组、CCI组和CCI+L-THP给药组（n=4/组）。通过行为学测试（机械缩足反射阈值MWT和热缩足潜伏期TWL）评估痛觉行为。分子水平验证则采用连接点特异性RT-qPCR检测关键基因的剪接比变化，以及通过IHC和IF技术检测目标RBPs（如GRN、ACTN3）及其预测靶基因（如NEFH、DGKZ）的蛋白表达与共定位情况。研究结果表明，在CCI诱导的神经性疼痛模型中，脊髓组织发生了广泛且复杂的可变剪接改变。这些差异剪接事件显著富集于轴突发生、细胞连接组装、突触组装等与神经元功能和发育相关的通路。尤其重要的是，与突触形成和重塑直接相关的多个基因，如Lrrc4c（轴突导向分子）、Nefh（神经丝重链蛋白）、Ctnnb1（β-连环蛋白）、Filip1、Rab3a（突触小泡调控蛋白）、Grid2（离子型谷氨酸受体δ2亚基）、Slitrk2和Nrxn3（突触粘附分子）等，在CCI组表现出显著的异常剪接模式。通过连接点特异性qPCR对Shank2（突触后支架蛋白）、Dgkz（二酰基甘油激酶ζ）、Ank3（锚蛋白G）、Filip1、Grid2和Rab3a等六个基因进行的体内验证，证实了它们在CCI模型中的剪接失调，且这些异常部分可被L-THP治疗所逆转，与RNA-seq数据趋势一致。此外，通过构建RBPs与RAS事件的共扰动网络，研究人员发现多个在CCI组显著上调的RBPs，包括Rbm47、Grn、Lcp2、Plek、Ptpn6和Hcls1，其表达水平与特定的RAS事件（如Nefh的剪接）存在显著相关性。免疫组织化学和免疫荧光实验进一步证实，CCI导致背根神经节（Dorsal Root Ganglion, DRG）神经元中GRN蛋白上调并与NEFH共定位，ACTN3表达改变且与DGKZ共定位，而L-THP治疗可部分纠正这些RBPs的表达异常及其与靶基因的共定位模式，提示L-THP可能通过调节关键RBPs的表达来影响其靶基因的异常剪接。
综上所述，该研究首次在转录组水平全面描绘了CCI大鼠模型神经性疼痛中脊髓组织的可变剪接图谱，明确了与突触重塑功能通路相关的异常剪接事件，并构建了RBPs调控网络。研究证实L-THP能够部分逆转包括Shank2、Grid2、Rab3a等在内的多个突触相关基因的异常剪接模式，同时调节Grn、Actn3等关键RBPs的表达，从而发挥缓解神经性疼痛的作用。这项发表于《RNA Biology》的研究为理解神经性疼痛的转录后调控机制提供了新视角，Rbm47、Grn、Nefh、Actn3和Dgkz等分子被识别为潜在的治疗靶点，为开发靶向可变剪接调控的神经性疼痛疗法奠定了理论基础。然而，研究也存在一定局限性，如分析基于单一模型和单一时间点的数据，RBPs与靶基因间的因果关系有待功能获得或缺失实验进一步验证。
