Westerdykella dispersa Ca4–13 发酵产物中螺连(Spiro-linked)聚酮类化合物作为 iNOS 关联神经炎症抑制剂的研究

《Journal of Natural Products》：Spiro-Linked Polyketides from Cultures of Westerdykella dispersa Ca4–13 as Inhibitors of iNOS-Associated Neuroinflammation

　　

对从台湾采集的食用牡蛎 Crassostrea angulata 中分离得到的真菌 Westerdykella dispersa Ca4–13 的发酵产物进行化学研究，研究人员从中分离得到7个化学成分，经波谱分析鉴定其结构分别为 westeroic acid A(1)、westeroic acid B(2)、westeroic acid C(3)、auranticin A(4)、auranticin B(5)、pilobolusone C(6) 和 epi-radicinol(7)。其中 westeroic acid A(1) 为含 γ-内酯官能团的新型 C14聚酮类化合物，westeroic acid B(2) 和 C(3) 为含独特 6/6-螺连 δ-内酯(spiro-linked δ-lactone)结构的罕见 C28聚酮类化合物。化合物 1、2、3 和 7 在脂多糖(LPS)诱导的 BV-2 小胶质细胞中表现出抑制一氧化氮(NO)产生的抗炎活性，IC50值范围为 9.9～11.3 μM。化合物 2 和 3 显著抑制 LPS 诱导的诱导型一氧化氮合酶(iNOS, inducible nitric oxide synthase)蛋白表达。使用小鼠 iNOS(PDB ID: 1QW4)进行的分子对接分析表明，有效抑制作用与 L-精氨酸结合口袋内的协同相互作用网络有关，而非单一主导相互作用。综上，这些发现提示上述化合物可作为神经炎症相关药物开发的潜在先导化合物。

论文解读：Westerdykella dispersa Ca4–13来源螺连聚酮类化合物抑制iNOS关联神经炎症作用研究

本研究发表于《Journal of Natural Products》。海洋来源真菌是结构多样次生代谢产物的丰富来源，牡蛎(Crassostrea spp.)因其滤食性生活习性承载复杂微生物群落，但牡蛎共生真菌的代谢潜力与化学多样性尚待深入挖掘。小胶质细胞介导的神经炎症是神经退行性疾病的关键致病机制，鉴定可调控一氧化氮(NO)产生及诱导型一氧化氮合酶(iNOS, inducible nitric oxide synthase)表达的真菌代谢产物具有重要意义。研究人员前期发现 Westerdykella dispersa Ca4–13 可产生具 NO 抑制活性的细胞松弛素类(cytochalasan)化合物，为进一步探明该菌株的化学多样性，采用 OSMAC(One Strain Many Compounds)策略促进其次生代谢多样化，经活性导向分离得到7个代谢产物，其中包括3个未见报道的聚酮类化合物，评价其对 LPS 诱导 BV-2 小胶质细胞抗神经炎症活性，并进行分子对接以阐明配体–iNOS 相互作用机理。结果表明 westeroic acid B(2) 和 C(3) 可显著抑制 iNOS 蛋白表达及 NO 产生，具开发为 iNOS 靶向抑制剂的结构模板潜力。

主要关键技术方法

研究人员从台湾食用牡蛎 Crassostrea angulata 中分离真菌 Westerdykella dispersa Ca4–13（GenBank 登录号 PQ005631），采用含海水葡萄糖?蛋白胨培养基液体发酵，运用 OSMAC 策略改变培养条件促进代谢多样化。发酵液乙酸乙酯提取物经 Sephadex LH-20 柱色谱及半制备 HPLC 进行生物活性导向分离纯化。化合物平面及绝对构型通过 HR-ESI-MS、1D/2D NMR(¹H, ¹³C, COSY, HSQC, HMBC, NOESY)及 TDDFT-ECD 计算确定。采用 LPS(150 ng/mL)诱导小鼠 BV-2 小胶质细胞模型，以 MTT 法检测细胞活力，Griess 法测定上清 NO(亚硝酸盐)水平并计算 IC₅₀，Western blot 检测 iNOS 蛋白表达。以小鼠 iNOS 晶体结构(PDB ID: 1QW4)为靶标，使用 Discovery Studio CDOCKER 协议进行分子对接分析配体在 L-精氨酸结合口袋的结合模式。

Results and Discussion

研究人员将 W. dispersa Ca4–13 发酵液乙酸乙酯提取物经 Sephadex LH-20 柱色谱及半制备 HPLC 分离纯化，得到化合物 1–7。其中化合物 1(westeroic acid A) 分子式 C₁₄H₁₆O₅（[M–H]^?m/z 263.0914），IR 提示共轭羧酸及 γ-内酯，综合 ¹H/¹³C NMR、COSY、HMBC 确立平面结构含 C₁–C₁₂共轭烯酸链及 C₁₄取代的 γ-内酯环，Δ²、Δ⁷、Δ⁹双键为 E 式，NOESY 未能确定 C-6 与 C-11 相对构型，TDDFT-ECD 比对确定 C-6 绝对构型为 R。化合物 2(westeroic acid B) 分子式 C₂₈H₃₀O₉（[M–H]^?m/z 509.1817），具两个共轭聚烯酸片段通过螺季碳连接形成环己烯环与六元 α,β-不饱和环酮共用螺碳的 6/6-spiro-linked δ-内酯骨架，NOESY(H-5′/H-9, H-5′/H-7′)指示 C-6′、C-7′、C-8 同面取向，ECD 计算确定 C-6′S,7′S,8S。化合物 3(westeroic acid C) 与 2 为平面结构相同的非对映异构体，NMR 信号差异及 NOESY(H-5′/H-8 有相关，H-5′/H-9 无相关；H-7′/H-14 相关)表明 C-6′ 与 C-8 处于反面、C-6′ 与 C-7′ 同面，ECD 确定 C-6′R,7′S,8S。其余已知化合物鉴定为 auranticin A(4)、auranticin B(5)、pilobolusone C(6) 和 epi-radicinol(7)。

研究人员检测化合物 1–7 对 BV-2 细胞活力及 LPS 诱导 NO 产生的影响，发现 1、2、3 在 20 μM 下显著抑制 NO 产生且细胞存活率 >90%，IC₅₀分别为 10.3 ± 0.5 μM、11.3 ± 0.2 μM、9.9 ± 0.6 μM，略弱于阳性对照姜黄素(curcumin, 2.7 ± 0.3 μM)；4–7 显示中等抑制，部分可能受细胞毒性影响。Western blot 显示 2 和 3（20 μM）显著下调 LPS 诱导的 iNOS 蛋白表达(p < 0.001)，1 仅呈边缘抑制。

研究人员以小鼠 iNOS(PDB ID: 1QW4)进行分子对接，发现 2 和 3 在 iNOS 活性中心 L-精氨酸识别口袋内形成有利结合取向，与 Arg260、Glu371、Asp376、Tyr367、Arg382 等残基形成氢键、盐桥及疏水作用的协同相互作用网络(cooperative interaction networks)；3 结合较紧凑围绕催化核心，2 作用分布较广但均有效稳定。化合物 1 结合取向较不理想，与催化残基协同作用较少，与其较弱抑制效应一致。结果表明有效抑制依赖协同氢键网络而非单一主导相互作用。

讨论与结论

综上所述，研究人员从 Westerdykella dispersa Ca4–13 中分离鉴定7个代谢产物，包括新型 C₁₄γ-内酯聚酮 westeroic acid A(1) 及罕见的含 6/6-spiro-linked δ-内酯 C₂₈聚酮 westeroic acid B(2) 和 C(3)。化合物 1、2、3 在 LPS 诱导 BV-2 小胶质细胞中抑制 NO 产生(IC₅₀9.9–11.3 μM)，其中 2 和 3 还显著抑制 iNOS 蛋白表达。分子对接表明 2 和 3 通过与 iNOS L-精氨酸结合口袋内关键残基(Arg260、Glu371、Asp376、Tyr367、Arg382)形成氢键及盐桥构成的协同相互作用网络发挥抑制效应，而非依赖单一强相互作用。这些螺连聚酮类化合物有望作为 iNOS 靶向抗神经炎症药物开发的先导结构模板。