《Frontiers in Toxicology》：Advancing chemical mixture toxicity assessment using advanced in vitro NAMs: current status and future perspectives
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现实场景下的化学暴露主要以混合物形式存在，而毒理学评估长期受单一物质范式主导。随着更具人类相关性、机制信息更丰富的测试策略受到关注，新途径方法学(New Approach Methodologies, NAMs)正日益融入混合物毒性研究。然而，先进体外NAMs
现实场景下的化学暴露主要以混合物形式存在，而毒理学评估长期受单一物质范式主导。随着更具人类相关性、机制信息更丰富的测试策略受到关注，新途径方法学(New Approach Methodologies, NAMs)正日益融入混合物毒性研究。然而，先进体外NAMs在化学混合物毒性评估中的作用尚未得到系统性梳理。本综述评估了先进体外NAMs当前在混合物毒性评估中的应用情况，并探讨了其在监管转化中的潜在价值。研究人员通过检索PubMed数据库中2021年至2025年发表的研究，共识别出353项基于体外NAMs的化学混合物毒性相关研究，其中70项被归类为先进体外NAMs研究并纳入深入分析。在先进体外NAMs类别中，暴露途径相关模型应用最为广泛，其次是组学(Omics)、三维(3D)模型、干细胞模型和高效筛选/高内涵成像(High-Throughput Screening/High-Content Imaging, HTS/HCI)方法。所综述的研究涵盖了多种混合物类型，包括空气污染物、全氟烷基和多氟烷基物质(Per- and Polyfluoroalkyl Substances, PFAS)、邻苯二甲酸酯、农药/除草剂、消费品相关混合物及其他环境相关化学组合。在这些研究中，先进体外NAMs不仅用于评估整体混合物效应，还用于比较观测响应与预测响应、区分混合物效应与单一化学物质效应、识别效应驱动组分，以及在生物学相关条件下解释非加和性响应。现有证据表明，先进体外NAMs并非仅作为替代测试系统使用，而是作为解决混合物毒性评估固有挑战的工具，包括定义相关混合物实体、识别毒性驱动因子、解释非加和性，以及在组合复杂性背景下支持优先级排序。这些发现表明，先进体外NAMs在未来混合物评估中的价值，不仅取决于技术的持续发展，更取决于其能否融入问题导向、适用性匹配(Fit-for-Purpose)的测试策略。从这个角度看，当先进体外NAMs用于生成与特定混合物评估需求和监管背景相契合的决策相关证据时，其贡献将最为有效。
1 引言
新途径方法学(New Approach Methodologies, NAMs)在当代毒理学中的地位日益重要，行业正寻求更具人类相关性、机制信息更丰富且适用性匹配的化学品安全评价方法。NAMs突破了传统低通量毒性测试的局限，实现了更高通量的筛选、响应丰富的表型分析、系统水平的分子谱分析以及更精细的体外建模，因此不仅被视为传统测试策略的替代方案，更是生成机制证据以支持综合毒理学评估的工具。在这一转型过程中，先进体外NAMs在技术多样性和生物学复杂度上均快速发展，近期平台整合了更丰富的分析输出和更具生物学相关性的模型结构，涵盖HTS/HCI、组学(Omics)方法、干细胞平台、三维(3D)组织模型及更能反映吸入或皮肤接触场景的暴露途径相关模型，可在从早期分子扰动到下游功能和组织水平响应的多个生物层级研究化学效应。与此同时，这些先进体外NAMs在化学混合物毒性评估中的应用尚未得到充分的结构化梳理。与单一物质评估不同，混合物毒性评估的挑战源于混合物本身的固有属性：真实共暴露往往表征不完整、化学性质多变且组成动态，难以界定相关混合物实体，也难以确定观测效应是否可由少数优势组分充分代表；此外，混合物可能诱导协同或拮抗等非加和性响应，但其生物学基础常难以解释；加之真实世界共暴露场景的数量和多样性极大，全面测试所有相关混合物在实践中不可行，因此混合物评估越来越依赖优先级排序、分层评估和多重证据的整合。在此背景下，先进体外NAMs的价值不仅在于提供更复杂的测试系统，更在于帮助应对这些混合物特有挑战，包括支持定义相关混合物、识别效应驱动组分、机制解释非加和性效应，以及在组合复杂性下进行更具策略性的评估。
本研究通过PubMed数据库检索2021年至2025年的相关研究，系统分析了先进体外NAMs在化学混合物毒性评估中的应用。研究人员首先将领域内主要技术类别划分为HTS/HCI、组学(Omics)、干细胞模型、3D模型及暴露途径相关先进体外模型，随后分析了这些方法如何助力解决混合物评估的关键挑战，尤其是相关真实混合物的定义、效应驱动组分的识别、非加和性效应的机制解释，以及组合复杂性下的优先级排序。
2 研究特征
研究人员通过分析PubMed数据库收录的文献，识别化学混合物毒性评估中体外NAMs的最新方法学趋势。为确保文献覆盖广度，采用包容性检索策略，布尔检索词为["Mixture" AND "Toxicity"]，未限定NAM类型或毒理学终点。系统检索2021年1月1日至2025年11月30日发表的研究，初筛获得7331条记录，去重后剩余7144条进入筛选。排除非原创文章及无效出版物类型（包括综述、荟萃分析、社论、指南、会议报告、勘误等）共710条，剩余6454条进行标题和摘要筛选。依据预设的合格标准，进一步排除非毒理学研究、非混合物毒性研究、非人类NAMs相关研究及非环境化学品相关研究，最终保留405篇文章进行全文评估。此阶段排除了52项计算机模拟(In Silico)研究，最终纳入353项研究作为分析对象，用于表征近期体外NAMs在化学混合物毒性评估中的应用特征。
3 基于NAMs的混合物毒性研究趋势
如图2A所示，纳入文献以传统体外研究为主（282项），先进体外研究占比较小但已形成一定规模（71项），另有52项为计算机模拟研究。由于本综述旨在梳理先进体外NAMs的方法学趋势，后续分析聚焦于71项先进体外研究。在化学类别方面（图2B），空气污染物是研究最多的类别（16项），邻苯二甲酸酯和全氟烷基及多氟烷基物质(Per- and Polyfluoroalkyl Substances, PFAS)次之（各9项），随后是农药和除草剂（9项）、金属（8项）、双酚类（7项）、环境基质（7项）、消费品（6项）、多氯联苯(Polychlorinated Biphenyls, PCBs)（6项）、多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)和烟草（各4项）、挥发性有机化合物(Volatile Organic Compounds, VOCs)（4项）及阻燃剂（3项）。这一分布表明，当前基于先进体外NAMs的混合物毒性研究集中于环境相关污染物类别，尤其是空气污染物和几类受监管重点关注的主要化学品。在毒性终点方面（图2C），呼吸毒性是最常研究的终点（19项），其次是皮肤毒性（12项）和肝脏毒性（11项）；生殖/发育毒性和神经毒性各占8项，致癌性相关终点较少（5项），其余归为其他类别（8项）。总体而言，当前研究主要关注器官和系统特异性结局，尤其侧重呼吸、皮肤和肝脏毒性。
3.1 靶向化学混合物
不同化学类别的混合物设计策略分布并不均匀（图3）。总体而言，重构混合物占比最高（n=33），其次是复杂混合物（n=29）和理论混合物（n=9），说明近期研究不仅限于简化的假设性组合，还越来越多地纳入实验重构混合物或更现实的暴露实体，如环境基质和消费品相关样本。同时，不同设计策略在各化学类别中的应用差异显著。
理论混合物主要集中在双酚类（n=3）和PFAS（n=2），消费品、持久性有机污染物(Persistent Organic Pollutants, POPs)混合物、农药和邻苯二甲酸酯各仅有1项。这表明理论混合物主要用于相对明确的化学组，通常在受控条件下验证特定组合假设。相比之下，复杂混合物以空气污染物为主（n=14），其次是消费品（n=7）和环境基质（n=4），VOCs、PAHs、农药和邻苯二甲酸酯各1项，说明复杂混合物设计多用于将混合物视为现实整体的暴露场景，而非简化为有限预定义组分。重构混合物则在邻苯二甲酸酯中报道最多（n=6），其次是POPs混合物（n=5）和农药（n=4）；PAHs、环境基质、金属和PFAS各3项，双酚类2项，空气污染物2项，VOCs和消费品各1项，表明重构混合物广泛应用于需在保留暴露相关性的同时仍能控制混合物组成以进行机制或比较评估的场景。
综上，近期靶向混合物研究并未遵循单一统一的设计原则，而是根据化学组特征和暴露背景采用不同的混合物构建逻辑（表1）。PFAS常作为主要化合物的相对明确组合进行研究，同时使用重构和理论混合物设计；邻苯二甲酸酯更多采用基于生物监测或人类暴露数据的重构混合物，尤其在生殖或发育相关研究中；双酚类则更多采用结合结构相关类似物的理论设计。总体而言，PFAS和邻苯二甲酸酯更倾向于暴露相关的重构，而双酚类更偏向理论驱动的对比。
混合物相互作用也存在差异：PFAS研究中既有加和性也有协同性响应，部分研究主要关注描述整体混合物响应特征而非正式检验相互作用；邻苯二甲酸酯研究更侧重于驱动因子识别或重构混合物间的比较，而非明确将相互作用定量分类为加和、协同或拮抗；双酚类则同时报道了加和、拮抗和非单调响应，提示该组的相互作用可能强烈依赖于终点和模型系统。这表明混合物相互作用不仅受化学组本身影响，还与混合物的构建方式、所用NAM平台及所选终点密切相关。
因此，近期靶向化学混合物研究已超越“哪些化学物质组合”的简单问题，转向更结构化地考量“为何以特定方式构建混合物”及“如何进行分析解读”。理论混合物在适合相似性比较的组别（如双酚类）中更为常见，重构混合物在具有较丰富人类暴露信息的组别（如邻苯二甲酸酯和部分PFAS）中更为普遍，而复杂或整体混合物方法则在空气污染物及产品或提取物相关暴露单元中更为突出。这一模式表明，靶向混合物评估正日益精细化，更好地反映了特定化学组的性质和人类暴露场景的现实。
3.2 靶向终点
先进体外NAMs混合物毒性研究的终点分布并不均匀，而是集中在特定靶器官和主要暴露途径（图2C）。总体而言，呼吸、皮肤和肝脏毒性是最突出的类别，其次是生殖/发育毒性和神经毒性，这种模式提示当前混合物研究主要围绕代表环境和消费品暴露场景下主要接触部位或毒理学关注的器官系统展开。
其中，呼吸毒性是暴露场景导向NAMs应用最活跃的领域之一。相关研究通常针对空气污染物、燃烧产物、电子烟气溶胶、挥发性有机化合物和颗粒物等吸入相关混合物，常采用气-液界面(Air-Liquid Interface, ALI)系统、共培养模型或器官型气道平台，终点不仅限于一般细胞毒性，还常包括氧化应激、炎症反应、屏障功能障碍和DNA损伤，体现了在更真实的吸入条件下关注早期组织相关响应的特点。皮肤毒性也呈现类似趋势，常使用重构表皮模型、全层皮肤模型和离体(Ex Vivo)皮肤外植体评估消费品或日常环境暴露相关混合物（如香料、表面活性剂、清洁制剂、纺织品化学品和空气污染物），主要终点包括皮肤刺激、致敏相关响应、细胞因子释放、屏障功能障碍和氧化应激，表明皮肤终点评估正逐步超越简单的刺激测试，转向更具暴露相关性的生物学响应。相比之下，肝脏毒性则是定义明确的混合物与机制或组学(Omics)读出的主要结合领域。PFAS、邻苯二甲酸酯、除草剂、PAHs和双酚类等定义明确的混合物常在HepG2、HepaRG、C3A、原代肝微组织和肝脏类器官等肝模型中评估，常见终点包括转录组或代谢组扰动、脂质代谢紊乱、氧化应激、内质网(Endoplasmic Reticulum, ER)应激和线粒体功能障碍，表明肝脏研究已成为结构化混合物评估和机制解释的主要领域之一。尽管研究数量较少，生殖/发育毒性和神经毒性因依赖人干细胞衍生系统和3D类器官等生物学高级平台而值得关注，这类研究中分化、谱系特化、神经突生长、突触发生和神经递质释放等终点比简单的活力结局更为常见，凸显了先进体外NAMs在捕捉高阶生物学过程中的价值。
总体而言，终点分布不仅反映了毒理学关注重点，也体现了暴露途径、靶器官和NAM平台的差异：呼吸和皮肤毒性与暴露途径相关模型紧密关联，肝脏毒性与基于组学的、面向组分的评估相关，而生殖/发育及神经毒性则与干细胞和类器官系统相关。
4 用于混合物评估的NAMs
为表征应用于混合物毒性评估的NAMs整体格局，研究人员将纳入研究分为五大技术组：HTS/HCI、组学(Omics)、干细胞模型、3D模型和暴露途径相关先进体外模型。其中暴露途径相关模型是应用最广泛的类别（28项），其次是组学(Omics)（17项）、3D模型（10项）、干细胞模型（9项）和HTS/HCI方法（7项）。这一分布表明，近期混合物毒性研究正日益超越传统的HTS或单终点筛选平台，转向更能反映组织背景和真实暴露条件的生理相关系统（图4A）。
各NAM类别的具体构成如图4B-F所示。在HTS/HCI类别中，高内涵成像/筛选(High-Content Imaging/Screening, HCI/HCS)方法比传统高通量筛选(High-Throughput Screening, HTS)更常用，HCI/HCS占5项，HTS占2项，提示基于图像的表型分析在捕捉混合物复杂细胞响应方面日益受到青睐。在组学(Omics)类别中，转录组学占主导地位（8项），其次是多组学(Multi-Omics)（4项）、蛋白质组学（3项）和代谢组学（2项），表明转录组水平扰动分析仍是研究混合物诱导生物学响应的最广泛应用系统级策略，而更广泛的多层分子谱分析正被更选择性地纳入。在干细胞基NAMs中，人诱导多能干细胞(human induced Pluripotent Stem Cell, hiPSC)模型应用最频繁（5项），其次是人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cell, hESC)系统（2项）和成体干细胞模型（2项），反映了评估混合物效应时对发育相关和人类相关平台的兴趣日益增长，尤其适用于分化、神经发育及生殖/发育毒性相关终点。在3D模型类别中，3D球体(Spheroid)（5项）和3D类器官(Organoid)（4项）比器官芯片(Organ-on-a-Chip)平台（1项）更常被采用，表明结构上先进但在技术上更易获取的体外系统目前在混合物研究中占主导地位，而非更复杂的微生理系统(Microphysiological Systems, MPS)。暴露途径相关模型的总体占比最高，其中吸入基系统（17项）多于皮肤模型（11项）：模拟吸入暴露的研究常采用ALI检测，因其能更真实地模拟气溶胶、颗粒物、挥发性化学品和其他空气传播混合物的暴露；而皮肤暴露评估主要依赖体外和离体皮肤组织模型，包括重构表皮、全层皮肤模型和离体皮肤外植体，特别适用于评估化妆品、消费品和环境样本中皮肤接触为主要途径的混合物。
4.1 HTS/HCI
HTS和HCI/HCS是代表性的系统基筛选NAMs，可在细胞系统中定量评估化学品或混合物诱导的生物学响应。HTS通常依赖自动化高密度板格式同时处理大量样本，聚焦相对有限的读数以实现快速响应评估；而HCI/HCS则将荧光成像与计算图像分析相结合，捕捉多维表型信息，包括细胞形态、细胞器状态和蛋白定位，这种差异影响了两者在混合物毒性评估中的贡献。
HTS方法主要用于大规模相互作用筛选或将混合物作为单一暴露单元进行整体毒性谱分析。例如，研究人员建立了基于OECD TG 455的自动化384孔雌激素受体报告检测方法，评估消费品相关内分泌干扰化学物的二元混合物雌激素活性，通过比较观测响应与浓度加和预测，将混合物效应分类为协同、拮抗或加和，并进一步用所得数据集训练随机森林(Random Forest, RF)和深度神经网络(Deep Neural Network, DNN)模型。另一项研究使用BioMAP Diversity PLUS面板评估香烟烟雾和下一代烟草气溶胶样本，在12种人原代细胞系统中量化148种与炎症、血管反应、组织重塑和免疫调节相关的蛋白生物标志物，此类研究将混合物视为复杂暴露单元，比较不同样本的整体毒性谱，而非解析组分水平的相互作用。
HCI方法则更常用于表征混合物在细胞水平诱导的表型和机制改变。例如，研究人员将HCI应用于人间充质干细胞成脂分化模型，量化双酚混合物暴露后的脂肪细胞数量、大小和脂质积累；使用基于Cell Painting的高内涵分析在MCF-10A细胞中检测PFOS/PFOA混合物，报道了低浓度下对细胞增殖和形态变化的潜在协同效应；在BEAS-2B细胞中结合活细胞HCS与深度学习图像分析，量化空气传播农药混合物诱导的线粒体网络破坏；还有研究将Cell Painting应用于多种人类细胞系的环境化学组合表型分析，展示了无靶向形态学分析在区分浓度和组合依赖响应中的效用。部分研究还将HCI评估与分子水平分析整合，例如在HepG2和HepaRG细胞中结合Cell Painting、代谢组学和脂质组学研究环境相关PFAS混合物，将混合物作为单一暴露单元，识别出浓度依赖和非单调响应，包括形态改变、线粒体异常，以及脂质、胆汁酸、类固醇和氨基酸代谢的扰动。综上，HTS特别适用于快速优先级排序和大规模相互作用筛选，而HCI/HCS则为识别细微、细胞类型特异且具有机制信息的混合物响应提供了更丰富的表型分辨率，在不仅需要检测混合物效应、还需表征这些效应如何在细胞和亚细胞水平显现时尤为有价值。
4.2 组学(Omics)
组学基NAMs是一类在不同生物层（包括基因、蛋白质和代谢物）捕捉混合物暴露诱导的分子水平扰动的策略，可在通路和网络层面进行解读，突破了终点特异性测量的局限，允许对生物学响应进行相对无偏倚的谱分析。根据分析的分子层，可分为转录组学、蛋白质组学、代谢组学和整合多组学，为解释复杂混合物效应提供互补信息。与聚焦可扩展响应谱分析的HTS/HCI不同，组学基NAMs能实现更深入的混合物诱导生物学变化的机制解读。
转录组学涵盖不同分辨率的平台，包括RNA测序(RNA-seq)、微阵列、TempO-Seq和靶向转录组学，已应用于肝细胞模型、胎盘、子宫内膜和卵巢等多种生物系统，覆盖PFAS、金属、除草剂、农药、药物和邻苯二甲酸酯混合物等多种化学组。部分研究直接比较单一化合物与混合物的基因表达响应，另一些则将混合物响应与预期加和效应（如基于浓度加和或相对效力因子的概念）相关联。代谢组学已应用于环境相关复杂混合物（如PM2.5或亚硝胺混合物），主要关注捕捉混合物暴露后的代谢物水平变化，而非定量解析单个组分间的相互作用。蛋白质组学方法应用于更复杂的测试系统（如气道器官型模型或3D人脑神经球体），关注特定分子层，包括细胞外囊泡货物变化、蛋白质修饰和共价加合物形成。整合多组学方法将转录组学与代谢组学、蛋白质组学或两者结合，主要应用于HepG2或HepaRG等肝体外系统，旨在通路或网络水平关联多个分子层的改变，而非简单呈现平行数据集。
4.3 干细胞
干细胞基体外NAMs是利用人源干细胞的分化能力在体外重现特定组织或发育过程的策略，可评估化学混合物如何影响这些过程，根据细胞来源和分化阶段可分为hESC基模型、hiPSC基模型和成体干细胞衍生系统。
hiPSC基系统包括广泛的谱系特异性和功能分化模型，如心肌细胞、神经干细胞、神经元/星形胶质细胞共培养、肝细胞、内皮细胞和多谱系分化系统，已应用于烟草提取物、POPs混合物、Pb-MeHg等二元金属混合物、多组分环境混合物和灾后沉积物提取物等多种暴露场景，评估的功能终点包括突触发生、神经突生长、脑源性神经营养因子(Brain-Derived Neurotrophic Factor, BDNF)表达和神经递质释放。hESC基模型仅在1项研究中出现，用于重现早期发育过程（如胚胎发生）：研究人员将反映母体暴露谱的23种环境污染物混合物应用于hESC基早期胚胎模型，评估凋亡、活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)生成、细胞周期阻滞、自噬和胚层特化，表明hESC基系统可捕捉超越简单细胞毒性的早期发育阶段混合物诱导扰动。成体干细胞基系统用于评估混合物对成脂分化的影响，研究使用人脂肪来源干细胞或间充质干细胞，评估BPA/BPF/BPS混合物或复杂环境混合物对脂质积累和成脂编程的影响，涉及雌激素
