氟化砜诱导白念珠菌细胞死亡中的麦角固醇依赖性膜应激与钙调神经磷酸酶-热休克蛋白90信号通路调控

《Mycopathologia》：Ergosterol-Dependent Membrane Stress and Calcineurin-HSP90 Signaling Govern Fluorinated Sulfone-Induced Cell Death in Candida albicans

　　

卤化甲基砜的抗真菌活性取决于卤代甲基磺酰基中卤素原子的类型和数量。本研究评估了28种卤代甲基苯基砜对白念珠菌的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MFC）。活性化合物随后使用Vero E6细胞系进行了体外细胞毒性测试。值得注意的是，化合物15，即4-(4-氯-3,4-二氯苯氧基)-2-硝基苯基二氟甲基砜，在有效剂量下表现出杀菌活性且无细胞毒性。此外，在体内使用大蜡螟幼虫进行的实验中，未观察到化合物15的不良影响。在亚抑菌浓度（2 μg/mL）下对化合物15进行的机制研究表明，其主要诱导白念珠菌细胞（88.43%）和原生质体（96.25%）发生坏死，并伴随活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生增加（31.17%）。细胞周期分析显示细胞停滞于G₀期（99%），这与促坏死机制一致。RT-qPCR分析表明HSP90基因的表达有助于白念珠菌对化合物15的耐药性。激光共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscopy, CLSM）证实了该化合物对体外浮游态和生物膜态白念珠菌的杀菌活性。使用外源麦角固醇进行的调控实验表明，降低固醇浓度可降低MIC值，这表明真菌细胞膜是化合物15的主要作用靶点，且其与麦角固醇的相互作用对其活性至关重要。总体而言，化合物15展现出与两性霉素B相当的抗真菌活性，是开发用于局部和全身性念珠菌病的新型抗真菌药物的一个有前景的先导候选化合物。

致病真菌中抗真菌耐药性的出现对真菌感染的有效治疗构成了重大挑战[1,2,3,4]。对包括氟康唑和两性霉素B在内的一线抗真菌药物的耐药性日益限制治疗选择并恶化临床结局[4,5,6]。白念珠菌通常是人类微生物群的组成部分，但在免疫功能低下的患者中可能变得危险[6]。鉴于常用抗真菌药物疗效下降和毒性问题[7, 8]，研究人员提出砜类化合物可能因其强效杀菌活性和低毒性而成为有前景的替代品[7,8,9,10,11,12]。先前的研究已证实，砜类是一类具有高杀菌活性和低细胞毒性的、有前途的未来抗真菌药物[9,10,11,12]。哺乳动物细胞中的坏死性凋亡途径是一种受调控的坏死性细胞死亡形式，其特征是膜通透化和离子稳态破坏，最终通过孔道形成导致细胞裂解[13]。尽管哺乳动物坏死性凋亡机制的经典组分在真菌中尚未被鉴定，但砜类化合物在白念珠菌中诱导的细胞死亡的若干特征显示出与坏死性凋亡显著的功能相似性[9]。钙调神经磷酸酶（calcineurin）信号通路对于决定白念珠菌对砜类的敏感性至关重要[9]。CNB1基因的突变会增加对砜类的敏感性并减少麦角固醇的产生，从而进一步增强敏感性[9]。这凸显了钙调神经磷酸酶在膜稳态和固醇生物合成中的作用[9]。因此，本研究纳入了CNB1缺失突变株，以评估钙调神经磷酸酶依赖性途径在细胞应对砜类药物处理中的参与情况。

研究人员评估了一系列含砜化合物作为针对白念珠菌的潜在新型抗真菌剂。在初步筛选后，他们测定了所测试化合物的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MFC）。一种在体外对哺乳动物细胞系无细胞毒性的砜类化合物随后使用大蜡螟感染模型进行了体内评估。这种被选定的砜类化合物被进一步研究其对真菌细胞周期的影响并阐明其作用机制。该研究通过分析白念珠菌对砜类处理的细胞反应和HSP90表达，在真菌致病的背景下研究了其细胞死亡。具体而言，它探索了砜类诱导的细胞死亡与HSP90调控之间的关系，以阐明抗真菌暴露期间激活的应激反应机制。使用CNB1缺陷菌株使研究人员能够评估钙调神经磷酸酶依赖性防御机制是否调节砜类化合物的抗真菌活性。为了进一步表征选定砜类化合物的生物活性，研究人员研究了其对白念珠菌-巨噬细胞相互作用和生物膜发展的影响。最终，基于收集的数据，他们确定该砜类化合物是一个值得进一步开发为新型抗真菌药物的候选分子。

在初步筛选中，化合物15表现出显著的潜力，其抑菌圈直径（lgR）为6.79，并在48小时后于4 μg/mL浓度下实现完全抑制。如图1所示，即使在杀菌浓度下，其细胞毒性仍低于50%，表明其具有值得进一步研究的良好安全性。为了评估化合物15在体内的安全性，使用大蜡螟幼虫进行了测试。结果显示，与阴性对照或溶剂对照相比，该化合物未对幼虫存活率产生不利影响。未观察到活动性的显著下降，导致测试组和对照组的健康评分相当。进一步的分析表明，无论采用何种给药方案，化合物15并未显著影响幼虫的存活率。值得注意的是，在120小时后，两个治疗组的健康评分均较念珠菌病对照组有显著改善。此外，黑色素化水平低于对照组，形成茧的能力也明显更高。这些发现表明，化合物15是抑制幼虫念珠菌病的一个有前景的候选分子，并凸显了其未来研究和开发的潜力。幼虫的半薄切片为评估化合物15在抑制念珠菌病方面的功效提供了有价值的见解。结果表明，两个实验组的结节均小于对照组，表明化合物15有效减少了白念珠菌在幼虫体内的增殖。因此，围绕真菌细胞的血细胞减少，导致结节形成减少。这些结果表明，化合物15可能在未来的念珠菌病管理中具有应用前景。

在本研究中，砜类化合物15主要诱导坏死性细胞死亡（表3），伴随膜损伤（图8）和反应性氧（reactive oxygen species, ROS）的显著增加（表2）。值得注意的是，砜类化合物15的抗真菌活性受外源麦角固醇的调节（图5），较低的固醇浓度导致较低的MIC值。这一发现表明化合物15的主要靶点是真菌细胞膜，且其与麦角固醇的相互作用在决定细胞命运中起关键作用。这种类似的固醇依赖性拮抗作用已在包括多烯类在内的膜活性抗真菌药物中有充分记载，其中外源麦角固醇会螯合药物并限制膜破坏[14]。鉴于麦角固醇在维持白念珠菌细胞膜通透性、流动性和完整性方面的核心作用[15]，干扰固醇依赖性膜结构被认为是灾难性膜衰竭和坏死性细胞死亡的合理触发因素。值得注意的是，哺乳动物系统中的坏死性凋亡通常与ROS产生升高和膜完整性快速丧失相关[13]，这些特征在化合物15处理的白念珠菌细胞中也十分明显（表2和图8）。尽管真菌的调控性细胞死亡（regulated cell death, RCD）通路与高等真核生物根本不同，但近期研究提出真菌中存在类似坏死和程序性坏死过程，这些过程在严重应激条件下被激活，特别是涉及膜损伤和氧化应激的情况[13]。在此背景下，砜类化合物15诱导的细胞死亡可能代表了真菌中一种类似坏死性凋亡的调控性坏死，而非经典凋亡，这与研究人员观察到尽管ROS水平升高（表2），但坏死占主导地位（表3）的结果一致。此外，有报道称砜类化合物可以干扰麦角固醇生物合成途径中的酶[16]，这支持了一种双重机制：砜类化合物15可能直接破坏膜完整性，并间接损害固醇稳态。这种联合效应会加剧膜不稳定性并促进坏死性细胞死亡，尤其是在补偿性应激反应途径被压倒时。综上所述，研究人员的发现表明，化合物15在白念珠菌中诱导了一种以膜为中心、与ROS相关的坏死性细胞死亡程序，其功能类似于哺乳动物细胞中的坏死性凋亡，尽管由不同的分子机制介导。

流式细胞术分析显示，砜类化合物15在抑菌浓度下诱导真菌细胞产生ROS，其水平比对照组高约300倍（表2）。升高的ROS水平通常与凋亡相关[17, 18]，因为这些物质在凋亡诱导中起关键作用。像伊曲康唑这样的知名抗真菌药物也会在ROS增加时引发凋亡和细胞应激。研究人员观察到凋亡细胞的存在表明，化合物15可能通过多种机制杀死白念珠菌浮游细胞，而不仅仅是破坏细胞膜。虽然砜类化合物已有多种作用模式的报道，但这些先前都与细胞周期调控而非ROS形成有关[10]。原生质体被杀死的速度比完整细胞更快，并且原生质体中观察到更高比例的坏死性死亡，这表明真菌细胞壁对化合物15具有通透性，但减慢了其向膜的扩散。这支持了化合物15通过破坏细胞壁起作用的观点，正如其他砜类化合物所报道的那样[10, 11]。如图6所示，一些对照细胞进入G₂/M期，为有丝分裂做准备，而用化合物15在抑菌浓度处理的细胞则停留在G₀期或S期，表明砜类化合物诱导了应激——这与先前的研究一致[19, 20]。在氧化应激下，处于S期的白念珠菌细胞比例下降，因为DNA在复制过程中最脆弱。潜在的抗念珠菌化合物可能诱导此类应激[19, 20]。

最引人注目的发现来自对HSP90表达的分析。如图7所示，无论是否补充钙离子，双钙调神经磷酸酶基因缺失突变株在化合物15处理后表现出比对照更高的HSP90水平。相比之下，单基因缺失突变株的蛋白质表达水平随钙离子的存在与否而变化。在培养基中没有Ca²⁺时，对照细胞产生的HSP90多于用化合物15处理的细胞。然而，在存在Ca²⁺的情况下，处理过的细胞表现出更高的HSP90表达。这些结果表明HSP90有助于白念珠菌对化合物15的耐药性[21, 22]。研究人员在先前的研究中发现[9]，砜类化合物显著增加了野生型白念珠菌细胞内罗丹明123（RH-123）的荧光，但在CNB1/cnb1?突变株中没有。这表明钙调神经磷酸酶对于砜类诱导的线粒体功能和膜电位变化至关重要。虽然砜类和RH-123的摄取是独立的，但在膜转运蛋白上的竞争表明它们可能共享相似的转运途径[9]。这些发现凸显了钙调神经磷酸酶调节膜应激反应和转运蛋白可用性，从而影响砜类衍生物的积累和功效。本研究强调了钙调神经磷酸酶在白念珠菌对砜类敏感性中的作用，将固醇稳态、膜转运和线粒体功能联系起来。靶向钙调神经磷酸酶途径可能增强抗真菌治疗的有效性。HSP90是白念珠菌毒力和形态发生的关键因子[23]。研究人员的发现表明该基因参与耐药机制，因此建议对化合物15进行进一步研究，特别是与HSP90抑制剂联用。虽然先前使用HSP90抑制剂的研究集中在氟康唑上，其作用方式与砜类化合物不同，但研究人员的结果表明，化合物15在超过MFC的浓度下能增加吞噬作用并抑制生物膜中的丝状化——这一点很重要，因为丝状生长驱动了白念珠菌的毒力。尽管化合物15处理的芽生孢子显示出HSP90表达升高，但还需要更多研究，因为生物膜的代谢与细胞悬浮液不同。未来研究比较砜类处理下不同白念珠菌形态型中的HSP90表达将有助于阐明砜类化合物如何靶向真菌及其毒力因子。研究人员的发现还揭示了砜类化合物15与氟化四唑类化合物[21]之间的机制相似性：两者均导致膜损伤（图8）、破坏真菌生理功能，并导致与氧化应激相关的非凋亡性、裂解性细胞死亡（表2和表3）。这表明，含有氟的抗真菌药物——包括四唑-苯二氮?衍生物和砜类化合物——可能涉及相似的应激反应和细胞死亡通路。靶向这些通路可能产生有效且宿主毒性降低的抗真菌治疗方法。

4-(4-氯-3,4-二氯苯氧基)-2-硝基苯基二氟甲基砜（15）是一种非常有前景的抗真菌候选分子，显示出对白念珠菌的强活性和低细胞毒性。在大蜡螟感染模型中，砜类化合物15延缓了疾病进展而不影响宿主存活。机制研究表明，砜类化合物15破坏真菌膜完整性、扰乱固醇稳态、诱导氧化应激、激活凋亡途径，并以钙调神经磷酸酶依赖性方式调节HSP90表达。重要的是，砜类化合物15还能增强宿主吞噬细胞对真菌的清除作用，并抑制生物膜中的丝状化，这是白念珠菌毒力的关键因素。这些发现凸显了砜类化合物15作为一个强有力的先导分子，值得进行进一步的临床前开发，并支持其作为联合治疗药物的潜力，以提高抗真菌疗效并降低宿主毒性。