《ELECTROPHORESIS》：Screening CZE–UV Green Method for Acetate, Propionate, Butyrate, and Valerate Analysis in Human Stool for Complementary Gut Dysbiosis Diagnosis
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短链脂肪酸（SCFAs）作为天然肠道菌群活性产生的发酵代谢物，在人体内具有重要功能。其评估可作为肠道菌群失调的生物标志物，为专业实验室的医生提供重要的健康评估。本研究建立了一种毛细管区带电泳结合间接紫外检测（CZE–UV）的方法，用于同时分离人体粪便样本中的乙
短链脂肪酸（SCFAs）作为天然肠道菌群活性产生的发酵代谢物，在人体内具有重要功能。其评估可作为肠道菌群失调的生物标志物，为专业实验室的医生提供重要的健康评估。本研究建立了一种毛细管区带电泳结合间接紫外检测（CZE–UV）的方法，用于同时分离人体粪便样本中的乙酸、丙酸、丁酸和戊酸。背景电解质（BGE）由15 mmol L?1的三(羟甲基)氨基甲烷（TRIS）、12 mmol L?1的3,5-二硝基苯甲酸（3,5-DNB）和0.5 mmol L?1的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）组成，pH值为7.5，运行时间为7.5分钟。所提出的方法对乙酸、丙酸、丁酸和戊酸的准确度分别为105.5%、90.12%、95.9%和86.6%，精密度分别为12.2%、8.96%、8.84%和18.3%的相对标准偏差（RSD）。优化后的CZE-UV方法作为一种潜在的补充性分析工具，已成功应用于98份来自肠道相关疾病调查患者的粪便样本的肠道菌群失调诊断检测，并结合了环保、快速、自动化、经济高效和高通量等特点。此外，该方法还通过示例如何将可持续分析实践整合到现代实验室培训和绿色化学原理教学中，体现了其教育价值。
近年来，随着人们对肠道健康与全身性疾病关系认识的深入，肠道菌群失调已成为一个重要的公共健康议题。肠道菌群失调指健康个体常驻微生物群发生的任何改变，其与多种代谢、消化、免疫及炎症过程密切相关，可能导致肠道内和肠道外疾病。不健康的生活方式、不当的饮食选择和环境因素均可直接影响人体健康。短链脂肪酸（SCFAs）是微生物发酵未消化碳水化合物（如膳食纤维）的主要产物，其中乙酸、丙酸和丁酸是主要的种类，分别约占总量的60%、25%和15%。这些物质不仅反映肠道活动，更作为关键的生物标志物用于评估菌群失调。例如，产生丁酸的厌氧菌（如属于变形菌门的肠杆菌科细菌）的过度生长常被视为菌群失调的标志。此外，戊酸虽然产量较少，但能通过蛋白质发酵提供辅助信息。SCFAs水平的变化被广泛用作肠道相关疾病（如炎症性肠病、结直肠癌等）的诊断和预后指标。
然而，目前SCFAs的常规检测方法，如气相色谱-质谱联用（GC–MS）、液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）或酶法/滴定法，往往存在操作复杂、耗时、使用大量有机溶剂、成本较高等缺点。同时，国际分析化学界正积极推动与绿色化学原则相一致的技术发展，强调减少有害试剂消耗、最小化废物产生并采用更安全可持续的实验条件。毛细管电泳（CE）作为一种基于分析物固有电泳迁移率差异进行分离的技术，因其选择性高、速度快、环保、自动化程度高且运行成本低等优势，成为替代传统色谱方法的有力候选。
为此，研究人员开展了一项旨在开发一种简单、可靠且环保的SCFAs分析方法的研究。他们建立并优化了一种毛细管区带电泳结合间接紫外检测（CZE–UV）的方法，用于同时定量分析人体粪便中的乙酸、丙酸、丁酸和戊酸。研究选择间接紫外检测，是因为这些脂肪酸缺乏可用于直接紫外检测的生色团。通过优化背景电解质组成（含发色团的3,5-DNB作为背景电解质探针，与TRIS缓冲，并添加CTAB以反转电渗流方向和极性）、电泳条件（温度、电压、毛细管长度等）以及开发简便的样品前处理流程，最终确立了高通量的分析方案。该方法成功应用于98份来自因肠道相关疾病就诊患者的粪便样本分析，验证了其临床实用性。研究结果表明，该方法准确可靠、环境友好且成本效益高，为临床实验室提供了一种有价值的辅助诊断工具，同时其设计理念也符合绿色化学原则，具有显著的教学价值。
研究人员为开展本研究用到的主要关键的技术方法如下：采用毛细管区带电泳（CZE）作为分离平台，使用配备二极管阵列检测器（DAD）的仪器，在优化的背景电解质（含TRIS、3,5-DNB和CTAB，pH 7.5）和电泳条件下（如电压-20 kV，毛细管有效长度60 cm）进行分析。采用间接紫外检测模式，检测波长为240 nm。通过柱上进样引入内标（甲酸，C1:0）进行校准，以补偿基质效应和进样误差。样品前处理包括将粪便样本用去离子水稀释（1:10, w/v）、离心去除蛋白质，并将上清液直接用于进样。方法验证使用质量控制（QC）样本和合成粪便基质进行。样本队列来源于Lemos Laboratórios de Análises Clínicas（LLAC）接收的98名（64名女性，33名男性，年龄1-91岁）接受胃肠道检查的患者。
本研究的主要结果如下：在CZE–UV方法特性方面，研究证实了该方法对目标SCFAs（C2:0-C5:0）具有良好的选择性。通过理论迁移率模拟和实际电泳图比较，证明在优化条件下，乙酸、丙酸、丁酸和戊酸能够与可能的干扰物（如磷酸盐、乳酸、异丁酸等）实现基线分离。间接紫外检测通过背景电解质探针（3,5-DNB）的位移产生信号，虽然灵敏度有内在限制，但证实适用于粪便中SCFAs的浓度范围。通过在BGE中添加CTAB成功反转了电渗流（EOF），使阴离子分析物得以在合理时间内迁移至检测窗口。
在方法验证方面，所建立的方法线性良好（相关系数R
2 > 0.84），检测限（DL）和定量限（QL）分别为0.0089-0.0441 mg mL
?1和0.0308-0.1133 mg mL
?1。准确度（以回收率计）在86.6%至105.5%之间，日内和日间精密度（以RSD计）分别为8.84%-18.3%和13.3%-20.0%。所有统计验证参数（如线性、准确度、精密度）均符合生物分析方法验证指南的要求，证明方法可靠。绿色化学评估（使用GAPI, AGREE, BAGI工具）显示该方法具有较高的“绿色度”，符合减少溶剂消耗和废物产生的原则。
在粪便样本分析方面，98份临床样本的分析结果显示，总SCFAs浓度和各组分（乙酸、丙酸、丁酸、戊酸）的百分比分布在不同患者群体（儿童、成年男性、成年女性）中存在差异。与提供的参考值范围相比，许多样本的总SCFAs浓度或个别SCFAs的百分比分布超出了正常范围，提示存在肠道失调。研究强调，这些分析结果本身不能直接作为最终诊断结论，需由医生结合其他临床信息进行综合评估，但该方法为评估患者肠道代谢活动和菌群状态提供了有价值的补充数据。
论文的讨论与结论部分指出，所开发的CZE–UV方法已被证明是量化人体粪便中SCFAs的一种可靠替代方案，具有成本效益和自动化优势。该方法通过简单的仪器、简化的样品前处理、极低的耗材消耗和环境友好的特性，能够为患者提供全面且富有信息的数据。其核心目标是推动像毛细管电泳这样简单而稳健的设备被纳入常规临床实验室工作流程，为医生提供信息以提高临床诊断的准确性。除了分析优势，本研究开发的方法还融入了多项绿色化学原则，如显著减少试剂消耗、消除有害有机溶剂以及简化样品前处理步骤。这些特性使得该技术不仅高效、经济，而且生态友好，这是现代临床实验室及分析与临床化学专业培训日益重要的要求。该方法在分析化学和绿色化学课程中也具有强大的教学潜力，它清晰地展示了如何通过合理选择分析技术来减少环境影响而不牺牲数据质量。将CZE–UV纳入教学活动，可能有助于培养未来专业人士采用更可持续的实验室实践，并推动环境友好型分析方法的更广泛应用。
