整合机器学习与计算方法从Jeevaneeya Rasayana中筛选癫痫NLRP3抑制剂

《Journal of Molecular Graphics and Modelling》：Integrated Machine Learning and Computational Approaches for Identifying NLRP3 Inhibitors from Jeevaneeya Rasayana in Epilepsy

　　

研究人员确立了一个基于机器学习（ML）的定量构效关系（QSAR）框架，用于评估传统阿育吠陀复方Jeevaneeya Rasayana中的植物化学成分作为癫痫中潜在的NLRP3（NOD样受体蛋白-3）抑制剂。该研究整合了传统阿育吠陀见解、广泛的回归基准测试和严格的验证策略。通过Lazy Predict Python库筛选出SVR、NuSVR、LGBMR和HGBR回归算法作为前四个模型，并随后使用scikit-learn进行优化。SVR（支持向量回归）模型展现出可靠的预测能力，表现出优越的内部验证结果（高q² = 0.679，r²_training = 0.797，较低的RMSE = 0.454），并完全满足Golbraikh和Tropsha的外部验证标准。模型的稳健性通过Y-随机化和适用域分析得到进一步证实。SVR模型准确预测pIC₅₀值，并识别出七种具有活性的、可穿透血脑屏障（BBB）的Jeevaneeya Rasayana植物化合物。分子对接（Molecular Docking）研究确定4',7-二羟基-3'-甲基黄酮（4',7-dihydroxy-3'-methylflavone）是一个有前景的先导化合物，具有良好的结合亲和力（-7.011 kcal/mol），并得到ADMET（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）和类药性评估的支持。此外，4',7-二羟基-3'-甲基黄酮与NLRP3复合物的结构稳定性和致密性通过500纳秒（ns）的分子动力学（MD）模拟进行了验证，并得到主成分分析（PCA）、自由能景观（FEL）和MMGBSA（分子力学广义波恩表面积）分析的佐证，同时密度泛函理论（DFT）计算证实了其电子和化学稳定性。总体而言，这些整合的计算研究结果突出了4',7-二羟基-3'-甲基黄酮作为一个有前景的支架，可用于靶向NLRP3的合理药物设计，并为进一步优化针对癫痫相关神经炎症的NLRP3抑制剂奠定了坚实基础。

癫痫（Epilepsy）或称“Apasmara”，是一种以反复、无诱因发作为特征的慢性神经系统疾病，由大脑中神经元异常同步放电引发[1], [2]。该病影响全球超过五千万至七千万人[3], [4], [5]，是第三大常见神经系统疾病[6]。癫痫的发展涉及多种因素，包括突触传递异常、离子通道功能改变，以及最重要的持续神经炎症反应，这些反应维持了发作易感性并导致脑细胞损伤[7]。实验和临床研究表明，癫痫不仅仅是神经电活动异常，因为神经炎症在癫痫的起始和复发中起着积极作用[6]。

近期研究已确定核苷酸结合寡聚化结构域样受体热蛋白结构域包含蛋白3（NLRP3）炎性小体是癫痫中神经炎症信号传导的关键介质[8]。NLRP3炎性小体由NLRP3受体蛋白、含有半胱天冬酶募集结构域（CARD）的凋亡相关斑点样蛋白（ASC）适配器以及pro-半胱天冬酶组成[9], [10]。其激活分为两个不同阶段：启动和激活。它始于模式识别受体介导的转录启动（信号1），并结束于通过各种损伤相关分子模式（DAMPs）（包括细胞外ATP、钾外流、活性氧（ROS）和线粒体功能障碍）进行的信号2激活[11]。一旦激活，NLRP3炎性小体会触发半胱天冬酶-1（Casp1），随后将促炎细胞因子白细胞介素-1β（pro-IL-1β）和白细胞介素-18（pro-IL-18）加工成其活性形式IL-1β和IL-18[8]。重要的是，异常的NLRP3炎性小体激活与多种疾病有关，包括癌症、自身免疫性疾病、心血管疾病以及神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病和癫痫[12]-[19]。异常的NLRP3激活通过促进炎症介质的释放，促进了癫痫的发生和发展，这些介质维持了慢性促炎环境，诱导神经元死亡、胶质细胞活化和过度神经元兴奋性，最终导致疾病进展[8], [16]。此外，癫痫发生过程导致的细胞应激会激活多条NLRP3通路，建立了神经元过度兴奋与炎性小体介导的神经炎症之间的病理循环[20]。

来自各种癫痫模型的实验证据证实，在易发癫痫的大脑区域中NLRP3表达升高[19]。红藻氨酸诱导的颞叶癫痫模型显示，更高的NLRP3水平导致更高的海马神经元丢失和更频繁的自发性反复发作[21]。同样，通过药理学或遗传学方法抑制NLRP3已被证明能显著降低戊四唑和匹鲁卡品诱导的癫痫模型中的发作频率、神经元损伤和胶质增生[21], [22]。然而，尽管有几种抗癫痫药物可用，但近30%的患者仍然表现出药物耐受性[23]，这强调了对新的、更有效的治疗策略的需求。研究表明，靶向NLRP3炎性小体信号通路的药物在临床前癫痫模型中产生了有效的治疗效果。实验研究已经证明，MCC950、格列本脲以及天然生物活性化合物能有效减少各种实验模型中的发作发生、神经元损伤和胶质增生[24], [25]。虽然研究取得了进展，但科学家们仍需深入了解NLRP3激活在癫痫发生过程中如何随时间展开，哪些细胞类型最影响炎性小体相关疾病进展，以及炎性小体靶向干预的最佳治疗窗口。将临床前结果转化为临床应用的主要挑战在于，科学家需要开发能够进入脑组织并具有类药特性的选择性NLRP3抑制剂。

天然多草药制剂因其多靶点药效作用，已成为一种有前景且丰富的生物活性分子来源。Jeevaneeya Rasayana是一种经典的阿育吠陀多草药制剂，由八种药用植物组成，包括天门冬（*Asparagus racemosus*，根茎）、印度牛舌草（*Boerhaavia diffusa*，根）、仙茅（*Curculigo orchioides*，根茎）、香附（*Cyperus rotundus*，块茎）、大叶水蓑衣（*Hygrophila auriculata*，种子）、蒺藜（*Tribulus terrestris*，全株）、刺毛黧豆（*Mucuna pruriens*，种子）和醉茄（*Withania somnifera*，根茎），其已被证明具有有效的抗炎和神经保护作用[26]。Jeevaneeya Rasayana中的生物活性化合物，包括皂苷、生物碱、黄酮类化合物和醉茄内酯（withanolides），因其通过清除ROS、调节NF-κB通路和破坏蛋白质-蛋白质相互作用来抑制NLRP3的能力而被认可。因此，靶向NLRP3具有治疗前景，因为与传统药物相比，这些抑制剂有可能在更少副作用的情况下治疗炎症[19]。

鉴于传统药物开发的高成本和长周期，机器学习（ML）算法越来越多地用于虚拟筛选（VS）和化合物优先级排序[27], [28]。在本研究中，研究人员采用ML方法进行虚拟筛选，以预测新的Jeevaneeya Rasayana生物活性分子的生物活性。这种方法与分子对接、分子动力学（MD）模拟和MMGBSA结合自由能计算相结合，以筛选能够调节NLRP3介导的癫痫通路的有前景的植物化合物。此外，还进行了密度泛函理论（DFT）计算和ADMET分析，以评估电子性质、反应性、稳定性和药代动力学，支持对安全有效的癫痫治疗候选药物的合理选择。

用于本研究开发的数据集：研究人员通过全面搜索ChEMBL和BindingDB数据库（http://www.bindingdb.org），建立了一个全面的NLRP3抑制剂数据集。这些存储库包括针对NLRP3抑制活性进行测试的各种化学化合物。从ChEMBL中，检索了靶向NLRP3（靶点ID：CHEMBL1741208）的生物活性化合物，获得了799个独特化合物的1,397条生物活性记录。该数据集涵盖了多种生物活性测量指标，如百分比活性、抑制率、EC₅₀、MIC等。数据整理：最初从ChEMBL数据库检索了1,397条生物活性记录，其中基于IC₅₀值的可用性，选择了843种靶向人NLRP3的化合物。经过手动整理和移除不完整条目后，剩余638种化合物。此外，从BindingDB数据库检索了2,010种NLRP3抑制剂，在排除具有模糊IC₅₀值的条目后，保留了1,754种化合物。合并两个数据集并去重后，最终形成了一个包含2,291个独特化合物的数据集，用作后续机器学习模型开发的训练集。

研究人员首先构建了包含2,291个化合物的NLRP3抑制剂数据集。通过Lazy Predict库初步筛选，并结合scikit-learn优化，确定了支持向量回归（SVR）模型作为最佳预测模型。该模型在内部验证中表现优异（q² = 0.679，r²_training = 0.797，RMSE = 0.454），并通过Golbraikh和Tropsha准则的外部验证。模型的稳健性通过Y-随机化和适用域分析得到确认。利用该SVR模型，研究人员从Jeevaneeya Rasayana的植物化学成分库中预测并筛选出七种具有潜在活性的、可穿透血脑屏障的化合物。

接着，研究人员对这七种化合物进行了分子对接研究，以评估其与NLRP3蛋白的结合能力。结果表明，4',7-二羟基-3'-甲基黄酮表现出最有利的结合亲和力，其结合能为-7.011 kcal/mol。该化合物与NLRP3关键残基形成了稳定的氢键和疏水相互作用。

为了进一步评估先导化合物4',7-二羟基-3'-甲基黄酮的药代动力学性质和类药性，研究人员进行了ADMET分析和类药五原则（Lipinski‘s Rule of Five）评估。结果表明，该化合物具有良好的口服生物利用度潜力、血脑屏障穿透能力，并符合类药标准，无明显毒性警报。

随后，研究人员通过500纳秒（ns）的分子动力学（MD）模拟，研究了4',7-二羟基-3'-甲基黄酮与NLRP3蛋白复合物的结构稳定性和动态行为。模拟分析，包括均方根偏差（RMSD）、均方根涨落（RMSF）和二级结构分析，证实了复合物在整个模拟过程中保持结构紧凑和稳定。主成分分析（PCA）和自由能景观（FEL）进一步揭示了复合物构象的稳定性。MMGBSA结合自由能计算提供了量化结合稳定性的能量数据。

最后，研究人员采用密度泛函理论（DFT）计算，在B3LYP/6-311++G(d,p)水平上分析了4',7-二羟基-3'-甲基黄酮的电子结构和化学稳定性。前线分子轨道（HOMO-LUMO）分析、静电势（ESP）映射以及福井函数（Fukui函数）计算，全面揭示了其化学反应性位点和内在稳定性，支持其作为潜在药物先导物的合理性。

研究讨论部分总结指出，癫痫是一种全球性负担沉重的神经系统疾病，其发病与神经炎症密切相关，尤其是NLRP3炎性小体的异常激活。尽管已有靶向NLRP3的抑制剂（如MCC950）在临床前模型中显示疗效，但开发具有脑渗透性和良好类药性的选择性抑制剂仍是关键挑战。本研究成功整合了机器学习虚拟筛选、分子对接、MD模拟、结合自由能计算以及量子化学计算等多种计算方法，从传统阿育吠陀方剂Jeevaneeya Rasayana中发现了一个极具潜力的NLRP3抑制剂先导化合物——4',7-二羟基-3'-甲基黄酮。该化合物不仅显示出对NLRP3的高亲和力结合，还通过了稳定性验证、ADMET评估和类药性分析。此研究凸显了计算方法在天然产物药物发现中的强大作用，为后续的先导物优化和针对癫痫相关神经炎症的新药研发提供了重要的理论依据和化合物起点。

研究结论部分翻译为：NLRP3炎性小体因其在癫痫以及其他神经退行性疾病如帕金森病和阿尔茨海默病中的发生和发展中的关键作用，在药物设计领域受到极大关注。因此，抑制NLRP3激活被认为是通过减轻神经炎症和降低发作活动来治疗癫痫的一种有前景的策略。随着过去几十年人工智能/机器学习的快速发展，这些计算工具已成为加速药物发现过程的强大助力。本研究成功地将基于机器学习的定量构效关系模型与基于结构的计算技术相结合，从传统草药制剂Jeevaneeya Rasayana中识别出4',7-二羟基-3'-甲基黄酮作为靶向NLRP3治疗癫痫的潜在先导化合物。该整合计算研究不仅为优化NLRP3抑制剂提供了坚实的基础，也展示了利用计算方法挖掘传统医学宝库以应对现代健康挑战的有效途径。