抑制IL-17通过NF-κB通路减轻伴高血糖弥漫性轴索损伤后的血脑屏障破坏

《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：Inhibition of IL-17 Alleviates Blood–Brain Barrier Disruption Following Diffuse Axonal Injury Accompanied by Hyperglycemia Through the NF-κB Pathway

　　

【摘要】 目的：阐明白细胞介素-17A（interleukin-17A，IL-17）在高血糖（hyperglycemia，HG）诱发的弥漫性轴索损伤（diffuse axonal injury，DAI）后血脑屏障（blood–brain barrier，BBB）破坏中的作用及机制。 方法：体外采用bEnd.3细胞建立BBB模型，通过4D-SmartDIA蛋白质组学分析对照组与高糖组间差异表达蛋白（differentially expressed proteins，DEPs）；体内采用瞬时旋转致伤装置建立SD大鼠DAI模型，腹腔注射50％葡萄糖模拟HG。双标免疫荧光和Western blotting检测IL-17受体（IL-17 receptor，IL-17R）定位与表达；ELISA检测脑组织和血清IL-17及炎性因子浓度；透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）及β-淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein，β-APP）、神经丝轻链与重链（neurofilament light/heavy chain，NF-L/NF-H）免疫组化评估轴索损伤；检测胶质反应与凋亡；伊文思蓝（Evans blue，EB）渗漏和紧密连接蛋白评估BBB通透性；以辛二酰苯胺异羟肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA）抑制IL-17通路，Western blotting检测核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65磷酸化（p-p65/t-p65比值）；比色法测定氧化应激水平。 结果：蛋白质组学显示高糖刺激bEnd.3细胞鉴定出444个上调及159个下调DEP，KEGG富集最显著通路含IL-17信号通路。DAI后脑组织和血清IL-17及IL-17R表达升高，HG进一步增强该上调；IL-17R主要定位于血管内皮细胞。HG加重DAI后轴索损伤、皮层凋亡与胶质反应，促进BBB破坏，升高促炎因子水平及氧化应激。抑制IL-17可逆转上述损害，通过维持紧密连接蛋白、降低促炎因子和氧化应激保护BBB完整性；机制上HG增加NF-κB p65磷酸化，SAHA显著抑制该磷酸化。 结论：IL-17通过NF-κB依赖性炎症和氧化应激破坏BBB完整性介导HG加重的DAI后轴索损伤，提示IL-17可作为减轻伴高血糖DAI中神经血管损伤的干预靶点。

论文解读：抑制IL-17通过NF-κB通路减轻伴高血糖弥漫性轴索损伤后的血脑屏障破坏

研究背景与意义

弥漫性轴索损伤（diffuse axonal injury，DAI）是创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）中因旋转或加减速暴力导致的严重病变，常并发应激性高血糖（stress-induced hyperglycemia，SHG）。临床研究表明SHG与TBI不良预后密切相关，高血糖可通过加剧氧化应激与炎症反应、破坏血脑屏障（blood–brain barrier，BBB）完整性而加重继发性脑损伤，但其具体分子机制尚未明确。白细胞介素-17A（interleukin-17A，IL-17）是重要的促炎细胞因子，在脑损伤后表达升高，但其于DAI合并高血糖背景下对BBB及轴索二次损伤的作用与机制尚不清楚。该研究假设DAI后高血糖上调IL-17表达，经核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路诱导BBB破坏及轴索损伤，并通过体外细胞实验与体内动物实验验证IL-17抑制的保护效应及机制。论文发表于Mediators of Inflammation。

主要技术方法概述

研究人员采用bEnd.3小鼠脑微血管内皮细胞系，分别以正常葡萄糖（25 mmol/L）和高糖（200 mmol/L）处理建立体外BBB模型，行4D-SmartDIA蛋白质组学分析差异表达蛋白（differentially expressed proteins，DEPs）及KEGG通路富集。选用雄性Sprague–Dawley（SD）大鼠，经瞬时侧向头部旋转装置制备DAI模型，腹腔注射50%葡萄糖（6.0 mL/kg，0 h和12 h术后）诱导高血糖（血糖>16.8 mmol/L维持24 h），设对照组、DAI组、DAI+HG组、DAI+HG+辛二酰苯胺异羟肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA，IL-23/IL-17轴抑制剂）组及DAI 3 d+HG组；SAHA于DAI造模后4 h腹腔注射（50 mg/kg）。检测指标包括：跨内皮电阻（transendothelial electrical resistance，TEER）与辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）通透率评价体外BBB通透性；双标免疫荧光定位IL-17受体（IL-17 receptor，IL-17R）；Western blotting检测紧密连接蛋白（claudin-5、ZO-1、occludin-1）、IL-17R、NF-κB p65及磷酸化p65（p-p65^Ser536）；ELISA测脑组织及血清IL-17、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10；伊文思蓝（Evans blue，EB）渗漏与湿干比重法测脑水含量（brain water content，BWC）评价体内BBB通透性；轴索损伤以β-淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein，β-APP）、神经丝轻/重链（NF-L/NF-H）免疫组化及透射电镜（transmission electron microscopy，TEM）观察；胶质活化以GFAP（glial fibrillary acidic protein，星形胶质细胞标记）、Iba-1（ionized calcium-binding adapter molecule-1，小胶质/巨噬细胞标记）免疫组化评估；TUNEL法测皮层细胞凋亡；比色法检测丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）、过氧化氢酶（catalase，CAT）反映氧化应激水平。

研究结果

3.1. High Glucose Impaired the Integrality of the BBB In Vitro（高糖体外损害BBB完整性）

高糖处理bEnd.3细胞后跨内皮电阻（TEER）下降、HRP通透量增加，证实高浓度葡萄糖可破坏体外BBB通透性。

3.2. Proteomic Analysis Using 4D-SmartDIA to Identify Differentially Expressed Proteins (DEPs)（4D-SmartDIA蛋白质组学鉴定差异表达蛋白）

对照组与高糖组bEnd.3细胞比对共鉴定603个DEP（444个上调、159个下调），KEGG富集分析显示IL-17 signaling pathway为最显著富集的通路之一，提示IL-17信号参与高糖致BBB内皮细胞改变。

3.3. HG Further Heightened the Level of IL-17 and IL-17R in Rats After DAI（HG进一步提升DAI后大鼠IL-17及IL-17R水平）

DAI 1 d组脑组织和血清IL-17及皮层IL-17R较对照组升高，合并HG后进一步升高；DAI 3 d+HG组较DAI 1 d+HG组略有回落，故选取DAI 1 d+HG进行后续干预实验。

3.4. Localization of IL-17R After DAI in Combination With HG in the Cortex of Rats（DAI合并HG后大鼠皮层IL-17R定位）

双标免疫荧光显示IL-17R极少与NeuN（神经元）、GFAP（星形胶质细胞）、Iba-1（小胶质细胞）共标，而与血管内皮细胞标记CD34显著共定位，表明DAI合并HG条件下IL-17R主要表达于脑微血管 endothelial cells。

3.5. Inhibition of IL-17 Relieved Nerve Cell Damage After DAI in Combination With HG（抑制IL-17减轻DAI合并HG后神经细胞损伤）

HE染色示HG加重DAI后神经元固缩、排列紊乱，SAHA干预改善病理改变；免疫组化示HG上调轴索损伤标记β-APP、NF-L、NF-H，SAHA显著降低其表达；TEM显示HG致微管解聚、线粒体空化，SAHA部分保留轴索微管连续性，提示抑制IL-17减轻轴索结构损伤。

3.6. Impacts of HG and IL-17 Inhibition on Glial Responses and Cell Apoptosis（HG及IL-17抑制对胶质反应与细胞凋亡的影响）

HG上调皮层Iba-1（小胶质活化）、GFAP（星形胶质细胞活化）表达并提高TUNEL阳性细胞率，SAHA处理显著抑制胶质活化标记物上调及凋亡率。

3.7. Role of IL-17 in Damage of BBB Integrality After DAI Combined With HG（IL-17在DAI合并HG后BBB完整性破坏中的作用）

DAI降低紧密连接蛋白claudin-5、ZO-1、occludin-1表达并增加EB渗漏与BWC，HG进一步降低紧密连接蛋白、加重EB渗漏及脑水肿；SAHA上调紧密连接蛋白表达，减少EB渗漏与BWC，证实IL-17介导HG对BBB的破坏，抑制IL-17可维护BBB完整性。

3.8. Inhibition of IL-17 Suppressed the Levels of Proinflammatory Factors and Oxidative Stress via the NF-κB Pathway After DAI in Combination With HG（抑制IL-17经NF-κB通路降低DAI合并HG后促炎因子与氧化应激水平）

DAI及HG递增p-p65/t-p65比值（NF-κB活化标志），SAHA显著降低该磷酸化水平。HG加重DAI后TNF-α、IL-1β、IL-6升高及IL-4、IL-10降低，SAHA逆转此趋势——降低促炎因子、回升抗炎因子。氧化应激方面，HG加重MDA升高及SOD、GSH、CAT下降，SAHA降低MDA并提升抗氧化酶水平，表明IL-17经NF-κB依赖途径调控炎症与氧化应激。

讨论与结论总结

讨论指出，本研究通过蛋白质组学筛选及体内外实验首次阐明DAI合并高血糖时IL-17/IL-17R在脑微血管内皮细胞高表达，HG进一步上调IL-17，激活NF-κB p65磷酸化，促进促炎因子释放与氧化应激，下调紧密连接蛋白致BBB破坏，进而加重轴索损伤、胶质活化及神经元凋亡；应用SAHA抑制IL-23/IL-17轴可阻断该级联反应，发挥神经保护作用。既往TBI中IL-17动态变化报道不一，本研究明确了DAI背景下伴HG时IL-17的早期上调模式及内皮细胞为主要作用靶细胞，补充了HG-exacerbated secondary injury的分子机制。SAHA兼具HDAC抑制及IL-17 axis抑制双重潜能，为本研究干预提供依据。

结论（翻译）

IL-17通过NF-κB依赖性炎症和氧化应激破坏血脑屏障完整性，从而介导伴高血糖弥漫性轴索损伤后的轴索损伤；这表明IL-17可作为减轻高血糖状态下弥漫性轴索损伤中神经血管损伤的潜在治疗靶点。