《Molecular & Cellular Proteomics》：dia-PASEF Enables Rapid Profiling of the Human Secretome for Deeper Insights into Cellular Dynamics and Inflammatory Mechanisms
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蛋白质分泌是细胞协调与信号传导的基本机制，其失调会导致广泛的生理功能障碍和疾病。利用次级抗体读数的免疫测定法是目前测量分泌蛋白的金标准，具有高特异性和灵敏度，但依赖于预定义的蛋白质面板，限制了新生物学的发现。研究人员提出了一种可扩展的基于质谱的工作流程，该流程
蛋白质分泌是细胞协调与信号传导的基本机制，其失调会导致广泛的生理功能障碍和疾病。利用次级抗体读数的免疫测定法是目前测量分泌蛋白的金标准，具有高特异性和灵敏度，但依赖于预定义的蛋白质面板，限制了新生物学的发现。研究人员提出了一种可扩展的基于质谱的工作流程，该流程结合了数据非依赖性采集（DIA）、离子淌度（Ion Mobility）和平行累积-串联碎裂（Parallel Accumulation-Serial Fragmentation， PASEF）技术，实现了分泌组的快速、全局谱学分析。利用具有转化相关性的人诱导多能干细胞（induced Pluripotent Stem Cell， iPSC）衍生的巨噬细胞模型，该方法在不到15分钟的采集时间内稳健地鉴定了超过900个蛋白质组，在大量样本中展现出卓越的重现性。研究人员应用此方法谱学分析促炎表型，不仅可靠地鉴定了关键的细胞因子和趋化因子，还发现了在靶向面板和细胞内蛋白质组中均缺失的非典型免疫反应。特别是，研究人员鉴定出一种独特的胆固醇外排特征，以载脂蛋白A1（Apolipoprotein A1， APOA1）和对氧磷酶1（Paraoxonase 1， PON1）的分泌为标志，这是对结核分枝杆菌（Mycobacterium Tuberculosis）的响应，与感染期间发生的代谢重编程一致。此外，通过对巨噬细胞在24小时内对脂多糖（Lipopolysaccharide， LPS）的响应进行时间谱学分析，解析了能够区分急性和慢性炎症状态的动态分泌轨迹。延长的时间段使得观察到不同的细胞因子依赖性分泌表型成为可能，其中肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor， TNF）和白细胞介素-6（Interleukin-6， IL-6）的早期分泌启动了下游信号级联反应，导致了趋化因子如C-X-C基序趋化因子配体10（C-X-C motif chemokine ligand 10， CXCL10）和C-C基序趋化因子配体8（C-C motif chemokine ligand 8， CCL8）的延迟分泌。总的来说，这些发现建立了一个稳健、可扩展的平台，用于分泌网络的整体表征。除了巨噬细胞生物学，该工作流程在生物标志物发现、疾病进展机制研究以及新治疗干预评估方面具有广泛效用，为推动精准医疗提供了强有力的工具。
**dia-PASEF技术实现人类分泌组快速谱学分析，深入揭示细胞动态与炎症机制**
蛋白质的主动释放与细胞表面蛋白的蛋白水解切割是协调和促进多种生理功能的基本过程，构成了功能多样的分泌组（Secretome），包括细胞因子、生长因子、激素和抗体等。分泌组在细胞通讯、免疫应答和组织稳态中扮演核心角色，其失调与癌症、炎症性疾病等多种疾病密切相关，使分泌蛋白成为重要的生物标志物和治疗靶点。然而，测量分泌蛋白的传统金标准方法，如酶联免疫吸附测定（ELISA），依赖于预定义的蛋白面板，需要预先了解分析物，可能限制了对复杂分泌组生物学的全面发现。因此，开发能够无偏倚、高通量且深入地分析分泌蛋白谱的技术，对于理解细胞行为、疾病机制和推动新药研发至关重要。
尽管基于质谱（Mass Spectrometry， MS）的蛋白质组学提供了无偏倚且深度的蛋白质分析能力，但其在分泌组研究中的应用受到通量和可扩展性限制。近期的技术进步，特别是捕获离子淌度谱（Trapped Ion Mobility Spectrometry， TIMS）与平行累积-串联碎裂（PASEF）的结合，显著提升了质谱分析的速度和灵敏度，为解决这一瓶颈提供了可能。本研究旨在开发、优化并应用一个稳健的分析工作流程，利用Bruker timsTOF平台在dia-PASEF模式下对人类分泌组进行谱学分析，以展示其在快速、深入表征免疫细胞分泌响应方面的潜力。
研究人员开展了以下研究并得出相应结论：首先，建立并优化了基于dia-PASEF的分泌组分析工作流程。研究使用来自三位人类供体的iPSC来源的巨噬细胞，在脂多糖（LPS）刺激下诱导促炎（M1）表型。通过比较丙酮沉淀法与甲醇-氯仿沉淀法，发现丙酮沉淀法能回收更多蛋白质，且提取物显著富集细胞外蛋白，方法简便高效。通过评估五种不同梯度速度的Evosep方法，确定了100个样品/天（SPD）的梯度是平衡蛋白质鉴定深度与通量的最佳选择，可在不到15分钟的采集时间内鉴定超过1200个蛋白质，且重现性极佳（皮尔逊相关系数 > 0.9）。通过使用小分子抑制剂TAK-242阻断Toll样受体4（Toll-like Receptor 4， TLR4）信号传导，验证了该工作流程能够药理学区分促炎和抗炎分泌表型。这一优化的工作流程为高通量、深度的分泌组研究奠定了基础。
接着，研究人员利用该工作流程比较了巨噬细胞对多种促炎刺激（LPS、干扰素γ（Interferon gamma， IFNγ）和热灭活细菌）的响应，以区分不同的M1极化特征。平行分析蛋白质组和分泌组发现，分泌组数据展现出清晰的刺激特异性聚类，且受供体变异影响较小，而蛋白质组数据则显示明显的供体效应，需要通过批次校正。对热灭活结核分枝杆菌（HKMtb）刺激的独特分泌谱进行深入分析，鉴定出一组以APOA1和PON1分泌为特征的胆固醇外排相关蛋白，这反映了巨噬细胞在结核感染时为维持脂质稳态而发生的代谢重编程。此独特特征在互补的基于核酸基底局部免疫测定技术（nELISA）的数据集中未被捕捉到，后者虽然可靠检测了关键细胞因子，但受限于抗体面板而无法揭示此类功能性差异。这凸显了基于质谱的分泌组学在发现新生物学特征方面的优势，与靶向免疫测定法的定量验证能力形成互补。
随后，研究人员将该工作流程应用于追踪巨噬细胞对LPS长达24小时的分泌动力学。通过系统性的时间点采样分析，鉴定出788个蛋白质组，其中216个具有显著的时间变化模式。这些蛋白被聚类为四种不同的动态曲线，分别对应于急性炎症反应中的代谢转变（如受体酪氨酸激酶活性蛋白下降）和细胞因子分泌的不同时间阶段。例如，TNF和IL-6在刺激后1小时内即被分泌，代表了早期炎症启动；而CXCL10等趋化因子则在6小时后才出现，依赖于早期细胞因子驱动的次级信号通路，反映了慢性炎症的特征。这种实时解析分泌动力学的能力，使得区分急性与慢性炎症状态成为可能。
最后，在讨论部分，研究人员总结指出，本研究建立了一个稳健、可扩展的dia-PASEF分泌组分析工作流程。该工作流程通过平衡蛋白质组学深度与分析通量（采用100 SPD方法），成功应用于iPSC衍生巨噬细胞模型，实现了快速、深入的炎症响应表征。研究结果揭示了炎症分泌组的复杂性，特别是发现了与结核感染相关的、基于胆固醇外排的独特分泌特征，这些是传统靶向抗体检测可能遗漏的。研究还证明，分泌组数据相对于蛋白质组数据具有更低的供体间变异性，这表明分泌组是一个受调控更紧密的动态系统。通过整合时间谱学分析，该平台能够捕捉从急性到慢性炎症的转变过程，为理解炎症进程和评估药物作用的时间窗口提供了强大工具。总而言之，该dia-PASEF分泌组学平台具有无偏倚、高通量、深度和高重现性的特点，超越了传统免疫检测的局限性，为疾病机制研究、生物标志物发现和精准医疗中的药物评估提供了新的技术手段。
