《Biochemistry and Biophysics Reports》：Role of Dlk1–Notch signaling in impaired neurogenesis and cognitive decline in chronic cerebral hypoperfusion
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血管性痴呆（VaD）的特征是慢性脑低灌注，会导致认知能力下降。海马神经发生受损是血管性痴呆的一个关键病理特征。Delta样同源物1（Dlk1）-Notch信号可能参与神经干细胞的调控，但Dlk1-Notch信号在低灌注期间受损的海马神经发生中的作用尚不清楚。在
血管性痴呆（VaD）的特征是慢性脑低灌注，会导致认知能力下降。海马神经发生受损是血管性痴呆的一个关键病理特征。Delta样同源物1（Dlk1）-Notch信号可能参与神经干细胞的调控，但Dlk1-Notch信号在低灌注期间受损的海马神经发生中的作用尚不清楚。在此，研究人员通过在双侧颈动脉狭窄（BCAS）诱导的慢性脑低灌注小鼠模型中，研究了Dlk1和Notch信号的作用。研究发现，BCAS会增加海马组织和脑脊液中的Dlk1水平，同时伴随着Notch细胞内结构域（NICD）表达升高以及双皮质蛋白（Dcx）阳性的海马细胞减少。这些变化与新物体识别能力受损有关。在Neuro2a细胞中，模拟缺氧的处理提高了NICD和细胞外Dlk1的水平，并降低了细胞活力；而药物抑制Notch信号则能部分挽救细胞损失并减弱这些变化。这些发现表明，Dlk1相关的Notch激活与慢性低灌注下的海马神经发生受损及记忆功能障碍相关。研究结果强调了改变的微环境信号与血管性痴呆认知衰退之间的潜在联系，为进一步机制研究提供了基础。
研究背景与意义
血管性痴呆（VaD）是全球第二常见的痴呆亚型，其核心病理机制为脑血管功能障碍引发的慢性脑低灌注。临床上，抗血小板药物及阿尔茨海默病药物均未能显示出显著的疗效，因此迫切需要寻找新的治疗靶点。神经干细胞（NSC）在海马体颗粒下区持续产生新生神经元，这一过程被称为神经发生，对维持突触可塑性和学习记忆至关重要。然而，在慢性低灌注状态下，导致海马神经发生受损的具体分子机制尚未明确。本研究聚焦于Delta样同源物1（Dlk1）-Notch信号通路，探讨其在慢性脑低灌注模型中对神经发生及认知功能的调控作用，旨在为揭示血管性痴呆的发病机制提供实验依据。
关键技术方法
研究人员采用了体内和体外相结合的研究策略。在体内实验中，利用双侧颈动脉狭窄（BCAS）手术建立小鼠慢性脑低灌注模型，并设置假手术组作为对照。通过新物体识别测试评估小鼠的认知功能，利用免疫荧光染色观察海马组织中间质细胞的数量变化，并通过蛋白质免疫印迹法检测脑组织及脑脊液中相关蛋白的表达水平。在体外实验中，采用氯化钴（CoCl2）处理Neuro2a细胞以模拟缺氧微环境，并使用γ-分泌酶抑制剂（DAPT）阻断Notch信号通路，通过细胞活力检测和蛋白水平测定，探究该信号通路在缺氧损伤中的具体作用机制。
研究结果
3.1. 小鼠在BCAS后28天表现出认知功能障碍和海马神经发生减少
研究人员在BCAS术后第28天进行了新物体识别测试。结果显示，与假手术组相比，BCAS组小鼠的辨别指数显著降低，而两组的总探索时间无显著差异，这证实了慢性脑低灌注成功诱导了认知功能障碍。进一步的免疫荧光染色分析表明，BCAS组小鼠海马齿状回区域的双皮质蛋白（Dcx，未成熟神经元的标志物）阳性细胞数量显著少于假手术组。这表明BCAS术后观察到的认知损伤很可能是由于海马神经发生的减少引起的。
3.2. BCAS后小鼠大脑中Dlk1-Notch信号被诱导
针对Dlk1-Notch信号通路的检测发现，BCAS组小鼠海马组织及脑脊液中的Dlk1蛋白水平均显著高于假手术组。同时，作为Notch受体信号活化标志物的Notch细胞内结构域（NICD）在海马组织中的蛋白表达量也明显升高。这些数据表明，Dlk1-Notch1信号通路在BCAS后被激活，可能参与了神经发生的抑制过程。
3.3. DAPT对氯化钴处理的Neuro2a细胞活力的影响
为了验证上述发现在细胞层面的机制，研究人员在体外用氯化钴处理Neuro2a细胞模拟低灌注缺氧环境。结果发现，氯化钴暴露24小时后，细胞活力显著下降。而当研究人员加入不同浓度的DAPT进行干预后，这种细胞活力的降低被剂量依赖性地缓解了。这说明抑制Notch信号能够拮抗缺氧造成的细胞损伤。
3.4. DAPT对暴露于氯化钴诱导缺氧的Neuro2a细胞的影响
进一步分析显示，氯化钴处理后，细胞内的缺氧诱导因子1α（HIF1α）和NICD蛋白水平均有所上升，且DAPT的加入能有效降低升高的NICD水平，但对HIF1α无影响。值得注意的是，虽然细胞内的Dlk1水平未受氯化钴或DAPT影响，但细胞培养上清液（细胞外组分）中的Dlk1蛋白浓度在缺氧处理后显著升高，而DAPT处理则显著抑制了这一释放过程。
3.5. DAPT对暴露于氯化钴诱导缺氧的Neuro2a细胞中凋亡蛋白水平的影响
在细胞死亡机制的探究中，研究人员检测了凋亡相关蛋白。结果表明，氯化钴处理24小时会显著增加cleaved caspase-3和自噬标记物LC3的蛋白水平。而DAPT的干预不仅挽救了细胞活力，还显著减弱了这两种蛋白水平的升高，提示Notch信号的激活促进了缺氧条件下的细胞凋亡与自噬应激。
讨论与结论
本研究探讨了Dlk1-Notch信号在慢性脑低灌注致血管性痴呆病理过程中的作用。研究人员发现，BCAS模型小鼠在术后28天出现了明显的认知功能下降，伴随海马齿状回神经发生标志物Dcx阳性细胞的减少。机制研究表明，这种损伤与Dlk1-Notch通路的异常激活密切相关：体内实验显示海马及脑脊液中Dlk1和NICD水平同步升高；体外实验证实，缺氧环境会促使细胞释放Dlk1并激活Notch信号，进而导致神经前体细胞死亡，而使用DAPT抑制该通路可有效恢复细胞活力并减少凋亡。
尽管本研究使用的氯化钴模型和Neuro2a细胞系在模拟复杂代谢及细胞异质性方面存在一定局限性，但其结果清晰地揭示了Dlk1/Notch信号与神经发生受损之间的关联。综上所述，慢性脑低灌注下Dlk1相关的Notch激活是导致海马神经发生受损及记忆功能障碍的重要因素，这为理解血管性痴呆的微环境信号改变提供了理论基础，也为未来的机制研究与药物开发指明了方向。
