综述：肌萎缩侧索硬化症的液体生物标志物：最新进展与未来前景

《Brain Research》：Fluid-based biomarkers of amyotrophic lateral sclerosis: recent advances and future prospects

　　姜一茹|胡书琪|杨冰洁|张玲玲|王颖|杨高毅|张浩
浙江中医药大学第四临床医学院，杭州第一人民医院，中国杭州

**摘要**
肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种毁灭性的神经退行性疾病，目前尚无根治方法。由于缺乏特定的诊断生物标志物，导致诊断延迟，从而阻碍了早期干预和治疗。本综述对多种来源的基于体液的ALS生物标志物进行了全面评估——包括脑脊液（CSF）、血液、尿液、唾液和眼泪——重点探讨了它们的诊断和预后潜力、局限性以及临床应用的准备情况。

虽然神经丝（NfL、pNfH）已被证实是神经轴突损伤的敏感指标，并越来越多地被用作临床试验中的预后和药效学标志物，但它们缺乏疾病特异性。反映ALS特异性病理的生物标志物，如TDP-43蛋白和C9orf72二肽重复序列蛋白（DPRs），虽然显示出潜力，但仍处于早期验证阶段，多中心数据有限。来自非侵入性来源的新兴标志物（尿液p75ECD、唾液嗜铬粒蛋白A、眼泪代谢组学）具有重复采样的潜力，但在临床应用前需要严格的外部验证。

为了解决当前的问题，我们引入了一个标准化的证据分级框架（1-3级）和全面的生物标志物研究报告模板，包括明确的性能指标（AUC、敏感性、特异性、置信区间）和验证状态。我们还提出了研究设计、分析前变量和统计严谨性的最低报告标准，这些标准基于REMARK指南。此外，还提供了生物标志物验证的路线图和跨体液比较矩阵，以指导未来的研究。

尽管取得了显著进展，但仍存在重大挑战，包括生物学异质性、分析前变异性以及外部验证不足。未来的工作应优先考虑多中心前瞻性研究、检测方法标准化、早期诊断的伦理框架，以及人工智能和数字孪生等新兴技术的整合。基于体液的生物标志物虽然还不能完全替代临床评估，但它们是加速药物开发、实现患者分层和推进ALS个性化医疗的重要工具。

**引言**
肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种罕见的严重神经退行性疾病，其特征是上下运动神经元逐渐退化（Anjum等人，2025年）。流行病学数据显示，ALS是最常见的成人运动神经元疾病，发病率在每10万人年0.6至3.8例之间（Longinetti和Fang，2019年；Zhou等人，2018年；Leighton等人，2019年；Palese等人，2019年）。典型生存期为3-5年，但部分患者可存活超过10年（Riva等人，2024年；Su等人，2021年；Robberecht和Philips，2013年；Chio等人，2009年）。ALS分为散发型/特发性和家族型/遗传型（Mitsi等人，2024年），其中散发型占大多数，家族型约占所有病例的5%-10%（Wolfson等人，2023年）。发病率和患病率因人群而异，受年龄和性别的影响，男性发病率较高，40岁以后发病率显著增加（Xu等人，2020年；Gianferrari等人，2022年；Levison等人，2025年）。从地理上看，欧洲和美洲的发病率较高（Gbd，2016年；Marin等人，2017年）。

ALS的标志性病理变化是运动神经元中细胞质包涵体的形成，这可能是由于TDP-43蛋白聚集所致（Merjane等人，2023年）。在正常情况下，TDP-43作为核蛋白发挥作用；但在ALS中，它错误地定位到细胞质中并形成不溶性聚集体（Liu等人，2021年；Park等人，2025年）。TDP-43的病理机制涉及其核功能的丧失（如RNA剪接异常）以及细胞质聚集体的毒性作用（Horiuchi等人，2024年）。TDP-43的功能障碍可能导致KCNQ2等基因的错误剪接，进而影响神经元兴奋性（Joseph等人，2025年）。

ALS的发病机制是多因素的，包括神经炎症（Magid-Bernstein等人，2022年）、RNA代谢紊乱（Colín-Castelán和Zaina，2019年）、氧化应激（Wang等人，2022年）、线粒体功能障碍（Wang等人，2022年）、细胞骨架异常、异常外显子剪接、核质和轴突运输障碍（Bhat等人，2019年）、有毒蛋白质聚集、自噬失调（Kim等人，2022年）以及谷氨酸诱导的兴奋毒性（Kim等人，2022年）。这些过程受到遗传易感性（Tsao等人，2023年）、有毒物质暴露（Coulson等人，2022年）和环境因素（Coulson等人，2022年；Meijboom和Brown，2022年）的影响。最近，公共卫生研究探讨了多种ALS风险因素，包括遗传倾向和神经炎症途径（Al-Chalabi和Hardiman，2013年；Talbott等人，2016年）。然而，其确切病因仍不完全清楚（Masrori和Van Damme，2020年）。

总之，ALS的早期诊断、治疗效果评估和预后判断仍面临重大挑战，这突显了需要能够在其临床前阶段检测和分期疾病的创新工具。生物标志物的发现已成为神经退行性疾病研究的关键焦点，有助于早期诊断和个性化治疗策略的实施。例如，脑脊液（CSF）生物标志物是阿尔茨海默病（AD）病理的公认指标（Cao等人，2025年）。通过体液生物标志物早期检测病理变化可能有助于及时干预，减缓或阻止ALS的进展。这些生物标志物对于评估药物疗效和治疗结果也至关重要。ALS的预后与多种体液中的分子标志物密切相关，监测这些标志物有助于深入了解疾病病理，准确评估疾病进展，并提供有价值的预后信息。此外，它们还支持临床试验中的患者分层（Mead等人，2023年；Feldman等人，2022年）。液体活检技术的进步引入了非侵入性方法来监测治疗效果，为个性化诊断和治疗提供了新的机会（Mead等人，2023年）。尽管进行了大量研究，但只有少数基于体液的ALS生物标志物被应用于临床实践。

本综述对有前景的生物标志物候选物进行了批判性评估，探讨了其临床验证和实施的主要挑战，并提出了促进其临床应用的实用策略，包括检测技术的进步和标准化的大规模验证协议的建立。

迄今为止，ALS生物标志物已被证明具有多种相互关联的作用，包括疾病诊断、监测疾病进展、预测治疗反应以及阐明潜在的病理生理机制（McMackin等人，2023年）。美国食品药品监督管理局（FDA）通过其BEST框架定义了标准化的生物标志物类别，将生物标志物分为七种亚型：诊断性、监测性、预测性、预后性、安全性和易感性/风险标志物（Staats等人，2022年；Group F-NBW，2016年，2016年）。

本综述的独特之处在于我们重点关注微创体液生物标志物——唾液、眼泪和尿液——作为传统CSF和血液采样的实用且患者友好的替代方案。虽然最近的综述已经全面涵盖了CSF和血液生物标志物，但我们特别探讨了来自非侵入性来源的新兴标志物如何补充现有标志物，用于纵向监测、早期诊断和远程患者管理。我们对唾液、眼泪和尿液生物标志物的证据进行了批判性评估，比较了它们与传统体液的临床可获取性和分析挑战，并提出了将多体液生物标志物组合纳入未来ALS临床试验和实践的框架。

**文献搜索策略**
为了确保透明度和可重复性，本综述采用了结构化的方法进行文献搜索。搜索范围从论文发表至今的PubMed和Web of Science数据库。搜索策略结合了与疾病相关的关键词（“肌萎缩侧索硬化症”或“ALS”或“运动神经元疾病”）以及与体液生物标志物相关的关键词（“生物标志物”、“脑脊液”或“CSF”、“血液”或“血清”或“血浆”、“尿液”、“唾液”、“眼泪”）。

**神经丝（NFs）**
神经丝是神经元轴突的主要结构成分（Liem等人，1978年），由轻链（NfL，约68 kDa）、中链（NfM，约160 kDa）和重链（NfH，约200 kDa）以及α-连接蛋白组成。这些亚单位以大约NfL:NfM:NfH = 4:2:1的化学计量比组装（Falzone等人，2021年；Yuan等人，2017年；Scott等人，1985年；Gafson等人，2020年）。神经丝在轴突运输和维持神经元代谢稳态中起关键作用。

**TDP-43**
TDP-43是一种多功能核蛋白，调节重要的RNA代谢过程，包括稳定、剪接和运输（Yang等人，2024年）。TDP-43的异常聚集是ALS的标志性病理特征，约97%的患者会出现这种情况（Garcia-Montojo等人，2024年）。在疾病状态下，TDP-43的病理表现为核内丢失和细胞质聚集，反映了其错误定位而非表达水平改变。

**二肽重复序列蛋白（DPRs）**
DPRs是由C9ORF72基因中的GGGCC六核苷酸重复序列通过非起始密码子翻译产生的神经毒性多肽。这些蛋白质在受影响个体的神经元中积累，损害星形胶质细胞的谷氨酸摄取，增加神经元对DPR诱导的毒性和谷氨酸兴奋毒性的敏感性（Shi等人，2018年；Jiang等人，2016年；Hao等人，2019年）。已鉴定出五种DPR类型——poly(GA)、poly(GR)、poly(GP)、poly(PA)和Tau蛋白。

**Tau蛋白生物标志物**
最近的研究在总Tau（t-tau）和p-tau作为ALS生物标志物方面取得了显著进展（Grossman等人，2014年）。t-tau和p-tau水平的变化可能反映广泛的神经退行性变化，但其确切机制尚不清楚。t-tau是一种微管结合蛋白，对轴突运输、生长和细胞形态至关重要（Cleveland等人，1977年；Süssmuth等人，2003年；Fj等人，2005年）。研究表明，ALS患者的CSF中t-tau水平略有升高。

**几丁质酶**
几丁质酶的表达和激活主要由胶质细胞功能障碍驱动（Tran等人，2025年）。这些酶主要由激活的胶质细胞分泌，但也可能由外周免疫细胞产生，包括星形胶质细胞中的几丁质酶-3样蛋白1（CHI3L1，也称为YKL-40）（Vu等人，2020年）和微胶质细胞或巨噬细胞产生的几丁质三糖苷酶-1（CHIT1）（Pinteac等人，2021年）。

**神经营养因子（NTF）生物标志物**
脑源性神经营养因子（BDNF）是一种对神经元生长、存活和分化至关重要的神经营养蛋白。BDNF在中枢神经系统中广泛表达，对维持运动神经元功能至关重要。一些研究表明，BDNF水平降低可能反映运动神经元营养支持不足。此外，ALS患者中BDNF受体和信号通路的异常可能破坏BDNF对运动神经元的保护作用（Tosolini等人，2023年）。

**其他生物标志物**
神经特异性烯醇酶（NSE）主要在神经元和神经内分泌细胞中表达。在正常生理条件下，CSF中的NSE浓度通常较低。在ALS患者中，神经元损伤会导致NSE释放到CSF中。当运动神经元受损时，细胞内的NSE会泄漏到细胞间隙，随后通过血脑屏障进入CSF，导致NSE水平升高（Tsukahara等人）。

**血清和尿液中的NFs生物标志物**
血清中的NF水平与CSF中的NF水平高度相关，在ALS患者中也通常升高，这可以在一定程度上反映神经细胞损伤（Behzadi等人，2021年；Haji等人，2022年）。升高的血清NfL（sNfL）水平与运动神经元退化、疾病进展和症状持续时间相关（Gille等人，2019年），可作为疾病分期的指标和治疗反应及早期监测的标志物。

**其他血液生物标志物**
8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8OH2′dG）是氧化DNA损伤的标志物，在ALS中水平升高，与疾病进展和神经功能障碍密切相关（Bogdanov等人，2000年）。CK主要存在于肌肉细胞中，催化能量代谢。ALS患者的CK水平通常升高，反映了肌肉分解、疾病严重程度和快速进展（Kittipeerapat等人，2023年）。热休克蛋白70（Hsp70）是一种分子伴侣蛋白，有助于维持蛋白质稳态。

**血液生物标志物的批判性评估和临床应用准备情况**
血液生物标志物相比CSF具有实际优势，但也带来了独特挑战：

- **分析稳健性**：使用Simoa或Elecsys平台测定的血清/血浆NfL表现出优异的分析性能（批间CV<10%）。然而，血液中的TDP-43测量受到血小板来源的TDP-43的干扰（血小板中含有高浓度的TDP-43），大多数商业检测方法无法区分中枢神经系统来源和血小板来源的TDP-43。
- **效应大小**：血清NfL显示出强大的诊断潜力。

**尿液生物标志物**
与血液和CSF相比，尿液易于收集，侵入性小，结构简单，适合重复采样和早期ALS诊断（Shi等人，2022年）。尽管ALS中的尿液生物标志物研究较少，但尿液代谢物和蛋白质标志物能有效反映神经系统健康和疾病进展。相关研究总结见表3。

**胶原蛋白代谢物**
胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，其代谢过程对组织结构和功能维持至关重要。在ALS患者中，神经炎症和氧化应激可能加速胶原蛋白降解，使胶原蛋白代谢物释放到血液和尿液中，从而反映ALS相关的病理过程。胶原蛋白降解产生的代谢物（如Glu-Gal-Hyl）成为有前景的ALS生物标志物（Ono等人，2001年）。近期研究指出，8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8-OH-2′dG）是氧化DNA损伤的生物标志物。尿液中的8-OH-2′dG最近作为肌萎缩侧索硬化症（ALS）的生物标志物受到了关注。其浓度反映了全身性的DNA氧化损伤情况，并提供了一种无创的监测方法。研究发现，尿液中8-OH-2′dG的水平与ALSFRS-R评分的变化呈负相关。此外，8-OH-2′dG的增加速率与临床进展的严重程度显著相关，这表明其在预后评估方面具有潜力。

**尿液生物标志物**
尿液生物标志物在重复采样方面具有独特优势，但面临一些特定挑战：
- **分析稳健性**：p75ECD ELISA检测方法的表现尚可（批内变异系数为10–15%）。然而，neopterin的测量需要通过尿肌酐进行标准化，以考虑水分状态的变化，而这一步骤在已发表的研究中常常被忽略，从而限制了结果的可比性。

**唾液生物标志物**
ALS领域的唾液生物标志物研究仍处于早期阶段，因此进行批判性评估对于指导未来的研究至关重要：
- **分析稳健性**：唾液中的chromogranin A和皮质醇检测方法在其他领域（如压力研究）已经得到广泛应用。然而，在ALS研究中，包括采集方法（被动流涎与拭子采集）、时间、食物摄入和口腔健康状况在内的预分析变量很少标准化，导致结果存在较大变异性。

**跨体液比较**
本综述的一个关键贡献是基于临床可及性和互补性对不同生物标志物来源进行了系统比较，评估了脑脊液（CSF）、血液、尿液和眼泪等体液的以下方面：
1. 采集的侵入性；
2. 可重复的纵向采样的可行性；
3. 患者的接受度；
4. 生物标志物的浓度和稳定性；
5. 当前的验证状态。

**最新进展**
最新的方法学进展有助于发现新的ALS生物标志物，逐步显示出其潜在的临床价值。

**当前挑战**
生物标志物的异质性仍然是一个重大问题。生物标志物的水平因年龄、性别、遗传背景、生活方式和共病情况而异。随着年龄的增长，脑脊液和血液中的生物标志物变异性增加，尤其是NfL的水平（Hemminghyth等人，2024年）。衰老和个体差异会损害血脑屏障的完整性，从而影响生物标志物的解读（Goodall等人，2018年）。ALS在疾病进展和生物标志物表达方面表现出临床和生物学上的异质性。

**整合伦理和设计标准以实现转化成功**
要将体液生物标志物从实验室应用到临床，技术验证必须与严格的伦理标准和稳健的研究设计协议相匹配。历史上，伦理问题常被置于次要位置；然而，随着向早期和无症状诊断的转变，需要采取综合性的方法。我们提出以下标准来解决当前存在的问题：

**早期风险分层的伦理框架**
体液生物标志物（如NfL峰值）在检测方面的潜力正在医学领域得到积极探索，其潜力在于预测和个性化护理（Li等人，2025年；Katsoulakis等人，2024年；Zhang等人，2024年）。对于ALS而言，数字孪生（DT）可以定义为一种针对患者的多尺度计算模型，整合了包括基于体液的生物标志物（如NfL、TDP-43蛋白）在内的纵向多模态数据。

**未来路线图：微创生物标志物与数字孪生的多模态整合**
为了推动该领域的发展，我们提出了一个三阶段路线图，将本综述中的关键主题——微创体液生物标志物（唾液、眼泪、尿液）和数字孪生方法——整合到一个统一的框架中，以实现个性化的ALS管理：
**第一阶段：建立多体液生物标志物基线（0–3年）**。当务之急是在大型多中心前瞻性队列中验证最有前景的二级和三级生物标志物。

**结论**
基于体液的生物标志物已成为诊断、评估ALS预后和监测治疗效果的宝贵工具。尽管它们具有巨大潜力，但仍面临诸多挑战。技术进步、人工智能的整合以及长期随访研究对于革新ALS管理至关重要。持续的研究、跨学科合作和技术创新是克服这些挑战的关键，以确保生物标志物成为ALS诊疗不可或缺的一部分。

**作者贡献声明**
- Jiang Yiru：撰写原始草稿、数据可视化、验证、概念化。
- Hu Shuqi：撰写与编辑、资源整理、方法学设计、数据管理。
- Yang Bingjie：撰写与编辑、项目管理、数据分析。
- Zhang Lingling：撰写与编辑、资金申请。
- Wang Ying：撰写与编辑。
- Yang Gaoyi：撰写与编辑、资金申请。
- Zhang Hao：撰写与编辑、监督工作、资源协调、资金管理。

**资助**
本研究得到了浙江省自然科学基金青年项目（LQ23H090016）、杭州市生物医药与健康产业发展支持科学技术专项（2024WJC185）、浙江大学医学院附属医院临床科学研究联合预研基金项目（YYJJ2019Z09）以及杭州市重点医学学科（运动神经元疾病）建设基金（2025HZZD09）的支持。

**致谢**
我们感谢BioRender（https://app.biorender.com）在数据可视化方面提供的帮助。