斑马鱼胚胎中基于生理学的动力学与毒效动力学（PBK-TD）建模：一种评估作用于脑芳香化酶的内分泌干扰化学物的新方法

《Computational Toxicology》：Physiologically based kinetics and toxicodynamic (PBK-TD) modelling in zebrafish embryos: A novel approach to assess endocrine disrupting chemicals acting on brain aromatase

　　

内分泌干扰化学物（EDCs）可通过调节雌激素信号通路（estrogen signaling pathways），包括脑芳香化酶 cyp19a1b 的表达，干扰神经发育。然而，在风险评估中，将外部暴露与内在剂量及生物学效应联系起来仍然是一项关键挑战。本研究开发了一个基于生理学的动力学-毒效动力学（PBK-TD）模型，用于描述斑马鱼胚胎中脑芳香化酶诱导的时间依赖性和浓度依赖性变化。采用 EASZY 检测方案，研究人员将转基因 tg(cyp19a1b:GFP) 胚胎自受精后 0 至 96 h 暴露于 3 种模型雌激素样化合物：17α-炔雌醇（EE2）、双酚 A（BPA）和双酚 F（BPF）。利用 GFP 荧光和实时定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）测量表征芳香化酶表达的时间动态。研究人员在既往建立的 PBK 模型基础上进行调整，以预测体内浓度，尤其是脑内浓度，并将其与一个描述芳香化酶诱导的间接反应毒效动力学模型耦合。PBK 模型能够较好预测所有化合物的体内浓度（大多数预测误差在 3 倍以内）。PBK-TD 模型成功捕捉到可诱导性的起始时间（约 44 hpf），并再现了 GFP 反应的完整时间过程。基于内在剂量-反应分析显示，不同化合物之间效力存在显著差异，其中 EE2 的效力明显高于双酚类。重要的是，基于内在浓度与外在浓度所得的相对效力排序并不一致，其中包括 BPA 与 BPF 之间排序的倒置。总体而言，本研究表明，将 EASZY 检测与 PBK-TD 建模相结合，可对内分泌活性进行更具机制相关性的评估，改善对斑马鱼胚胎检测结果的解释，并且是迈向定量体外-体内外推（qIVIVE）和定量不良结局通路（qAOP）发展的第一步。

该文发表于《Computational Toxicology》，聚焦于内分泌干扰化学物（EDC）在胚胎神经发育阶段的作用机制评估，尤其关注其通过雌激素受体（ER，雌激素信号转导关键受体）调控脑芳香化酶 cyp19a1b 表达所产生的效应。研究背景在于：已有大量研究提示环境污染物可扰乱发育期脑芳香化酶表达，流行病学证据也显示 EDC 暴露与神经发育或神经认知障碍相关，但从外部暴露到靶组织内在剂量，再到分子与表型效应之间的定量联系仍不清晰。这一缺口限制了对相关化学物神经内分泌危害的精准风险评估。斑马鱼胚胎因其内分泌通路保守、遗传可操作性强且胚体透明，已成为研究发育毒性和内分泌干扰的重要脊椎动物模型；其中 tg(cyp19a1b:GFP) 转基因系可通过 GFP 信号报告脑芳香化酶相关雌激素活性，是 EASZY 检测的基础。然而，报告基因检测多停留在外暴露浓度与终点响应之间的经验关联，未充分纳入体内吸收、分布以及发育过程中器官变化等毒代动力学（TK）信息。因此，开展本研究的必要性在于建立连接外部暴露、脑内浓度与芳香化酶诱导效应的整合模型，以增强检测结果的机制解释力，并为定量体外-体内外推和 qAOP 构建提供基础。

研究人员围绕这一目标，建立了一个用于斑马鱼胚胎的基于生理学的动力学-毒效动力学（PBK-TD）模型，用于表征早期暴露于雌激素样化学物后脑芳香化酶诱导的时间-浓度响应关系。实验上，研究人员使用 tg(cyp19a1b:GFP) 斑马鱼胚胎，将其从 0 至 96 hpf 分别暴露于 17α-炔雌醇（EE2）、双酚 A（BPA）和双酚 F（BPF），在 24、48、72 和 96 hpf 获取 GFP 荧光数据，并在选定时间点检测 cyp19a1b、esr1、esr2a 和 esr2b 的 mRNA 表达。建模上，首先采用既往建立的斑马鱼胚胎 PBK 模型预测体内尤其是脑内浓度，再将其与一个间接反应 TD 模型耦合，以描述芳香化酶诱导过程。研究表明，该 PBK 模型对 3 种化合物体内浓度具有较好预测能力；TD 模型则成功刻画了约 44 hpf 才出现的系统可诱导性以及 GFP 响应的完整动态过程。最终得出的重要结论是：基于脑内浓度的内在剂量-反应关系与基于水中浓度的外在剂量-反应关系并不一致，说明单纯依赖外部暴露指标可能误判化学物相对效力；其中 EE2 的效力显著高于双酚类，而 BPA 与 BPF 的相对排序在内外剂量评价间发生倒置。这一发现对环境内分泌毒理学和机制化风险评估具有重要意义。

研究所用主要技术方法可概括如下：其一，采用 OECD TG 250 相关的 EASZY 检测体系，对 tg(cyp19a1b:GFP) 斑马鱼胚胎进行连续暴露并动态采集 GFP 荧光；其二，通过 RT-qPCR 检测 cyp19a1b、esr1、esr2a、esr2b 的表达变化以验证报告基因结果；其三，使用液相色谱-串联质谱（LC/MSMS）测定水体与胚胎内化学物浓度；其四，基于既有多器官斑马鱼胚胎 PBK 模型并结合贝叶斯校准，预测不同化合物在胚胎尤其脑组织中的内在暴露；其五，构建间接反应 TD 模型并与 PBK 耦合，定量表征脑芳香化酶诱导的时间-剂量动态。实验样本来源为研究机构自繁育的成年 tg(cyp19a1b:GFP) 斑马鱼所产受精卵。

3.1. Experimental results
实验结果显示，在每日更新培养液的半静态暴露条件下，3 种 EDC 在水中的浓度于 72 至 96 hpf 间下降均低于 12%，表明暴露条件总体稳定。胚胎内实测浓度呈现化合物特异性动力学特征：BPA 与 BPF 的体内浓度随暴露进程下降，而 EE2 在 96 h 暴露期内持续累积。基因表达分析显示，对照组中 3 种雌激素受体亚型 esr1、esr2a、esr2b 在 24 至 48 hpf 间有轻度时间性升高，随后趋于稳定。BPA 与 BPF 暴露对 esr 表达整体影响有限，仅在个别时间点出现轻微且不具剂量依赖性的转录变化。对于 cyp19a1b，RT-qPCR 与 GFP 定量在 BPA 和 BPF 暴露条件下总体一致，75% 的数据点差异处于 2 倍以内，支持 GFP 作为内源性 cyp19a1b 表达替代指标的有效性。

3.2. PBK model
PBK 模型结果表明，BPA 暴露未见明显孵化延迟。模型对 BPA 和 BPF 的观测值与预测值具有较好一致性，分别有 70% 和 100% 的观测浓度落在 3 倍误差范围内；对 EE2 的预测表现更佳，96% 的观测值位于 3 倍误差范围内，提示既有模型结构对不同雌激素样化合物具有较强稳健性。模型同时显示，卵黄分配系数所需修正幅度明显高于其他组织，提示用于预测分配系数的 QSAR 方法系统性高估了卵黄中的化学分配。这一结果说明，卵黄组成及其时间动态变化可能是胚胎期毒代动力学建模中的关键不确定来源。尽管存在这些限制，模型总体仍能合理预测脑等组织中的化学物归趋，为后续 PBK 与 TD 耦合提供了可靠基础。

3.3. TD model
3.3.1. External dose-response relationship with regression model
基于外部浓度的静态剂量-反应回归显示，3 种化合物在 24 hpf 均未观察到诱导效应，且此时 GFP 倍数变化变异度较高。从 48 hpf 起，BPA 与 BPF 在不同时间点的 EC₅₀ 总体相近，但最大诱导倍数随时间增加，提示系统在后期发育阶段的可诱导性增强，或 GFP 蛋白存在时间累积。EE2 方面，由于 48 和 72 hpf 的测试浓度分布对剂量-反应关系刻画不够理想，EC₅₀ 估计不确定性较大；纳入历史 EASZY 数据后，96 hpf 的 EC₅₀ 估计得到明显改善。该部分结果表明，仅依赖单一时间点外暴露浓度进行效力比较，容易受到实验设计和响应动态的影响。

3.3.2. Internal dose-response relationship with PBK-TD model
PBK-TD 模型较好拟合了对照组及暴露组 GFP 诱导动态。对照条件下，模型首先拟合了构成性 cyp19a1b 表达随时间变化的轨迹；在此基础上，进一步结合脑内浓度模拟暴露后的诱导效应。模型估计的 φ 参数约为 43.2–44.8 hpf，且在 3 个独立数据集间高度一致，表明斑马鱼胚胎脑芳香化酶系统在这一发育窗口前基本缺乏可诱导性。就内在剂量-反应参数而言，EE2 的 SC₅₀ 远低于 BPA 和 BPF，约低 3 个数量级，而 BPA 与 BPF 的 SC₅₀ 相近但 BPF 略低；同时，EE2 的最大诱导能力 SCmax 约为双酚类的 10 倍以上。这些结果不仅重现了不同化合物间效力差异，也表明最大效应水平本身具有化学物特异性，不能仅由外暴露强度推断。

3.3.3. Comparison of the toxicodynamic parameter
对内外剂量-反应关系的比较是本文最重要的结果之一。基于外部浓度的 96 hpf EC₅₀ 显示 EE2 与双酚类之间存在极大的效力差距；而在纳入毒代动力学并采用脑内浓度后，这种差距虽仍显著，但大幅缩小。更重要的是，使用内在浓度时，BPF 的半数最大效应浓度低于 BPA，而以外部浓度为基础时则呈相反排序。该结果说明，化学物在胚胎体内的吸收、分布与富集差异足以改变相对效力判断，从而影响危害排序与等效系数应用。

讨论部分指出，本研究成功将 EASZY 检测与 PBK-TD 建模整合，能够同时描述化学物在斑马鱼胚胎中的动力学过程及脑芳香化酶诱导的时间动态，从而实现对内分泌活性的更机制化解释。首先，在毒代动力学层面，BPA、BPF 与 EE2 的体内动态差异提示其生物富集潜能不同，且即便在数据有限情况下，模型仍对验证数据集给出较准确预测。研究人员同时指出，未来可通过引入血液循环、改进卵黄吸收与分配过程，进一步提升模型的生理真实性。其次，在发育时间窗方面，24 hpf 未见诱导、48 hpf 后出现响应，与雌激素受体表达上升相吻合，说明早期 cyp19a1b 诱导依赖于受体系统成熟。再次，在毒效动力学层面，GFP 与 RT-qPCR 的一致性支持报告基因信号作为 cyp19a1b 表达代理终点，而 PBK-TD 模型通过整合全部时间点数据，得到与时间无关的内在 SC₅₀，较单时间点 EC₅₀ 更稳健，更适合 qIVIVE。讨论还强调，传统基于外暴露的等效因子往往忽略 TK 差异，可能错误估计相对内分泌效力，因此在鱼胚胎危害评估及向人体健康风险评估外推时，应显式纳入毒代动力学因素。

研究结论部分可译为：本研究表明，将实验数据整合到基于生理学的动力学-毒效动力学（PBK-TD）框架中，对于准确描述和比较斑马鱼胚胎发育过程中雌激素样化合物的内分泌效力至关重要。通过明确考虑内在浓度及其时间依赖性动态，模型揭示了不同化合物之间、甚至同一家族化合物内部相对效力的显著差异。除改进危害表征外，本研究还凸显了传统基于外部剂量的指标以及基于体外数据的等效因子存在局限。总体而言，所提出的框架为定量体外-体内外推（qIVIVE）应用及未来整合至预测性定量不良结局通路（qAOP）模型奠定了坚实基础，并可支持环境风险评估。