《Current Research in Parasitology & Vector-Borne Diseases》：A national survey of gastrointestinal nematodes in Australian dairy goats using faecal egg counts and deep amplicon sequencing
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胃肠道线虫（Gastrointestinal nematodes, GINs）在全球范围内严重制约着山羊的健康、福利及生产力。在澳大利亚，GINs被认为是山羊面临的优先级最高的地方性病原体，然而，记录山羊GINs患病率的综合性全国数据依然有限。本研究旨在调查奶
胃肠道线虫（Gastrointestinal nematodes, GINs）在全球范围内严重制约着山羊的健康、福利及生产力。在澳大利亚，GINs被认为是山羊面临的优先级最高的地方性病原体，然而，记录山羊GINs患病率的综合性全国数据依然有限。本研究旨在调查奶山羊体内GINs的患病率、感染强度、物种多样性及相关风险因素。在一项横断面研究中（2023年11月至2024年7月），研究人员采用改良McMaster技术分析了来自68个牧群（herds）的1028份粪便样本。研究人员利用核核糖体DNA第二内部转录间隔区（nuclear ribosomal DNA second internal transcribed spacer, ITS2）的深度扩增子测序技术，对500份样本中的圆线虫（Strongylid）物种进行了鉴定。动物水平的患病率估计针对牧群水平的GIN阳性聚集效应进行了调整，并利用线性混合效应模型评估了与圆线虫粪便虫卵计数（faecal egg counts, FEC）相关的风险因素。总体而言，92%（95%置信区间, CI: 89–95%）的山羊和100%的牧群对至少一种GIN分类单元呈阳性。圆线虫表现出最高的调整后动物水平患病率（91%, 95% CI: 87–94%），其次是毛首线虫属（Trichuris spp.，13%, 95% CI: 10–17%）和细颈线虫属（Nematodirus spp.，5%, 95% CI: 3–8%）。圆线虫FECs呈现出显著的过度离散分布（overdispersed），其中30%的山羊贡献了总排卵量的80%。年龄、气候带、驱虫史以及艾美耳球虫属（Eimeria）合并感染与圆线虫FECs显著相关。宏条形码技术（Metabarcoding）鉴定出11种圆线虫物种，主要以捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）、环纹奥斯特线虫（Teladorsagia circumcincta）和蛇形毛圆线虫（Trichostrongylus colubriformis）为主。捻转血矛线虫在全国范围内的丰度和流行率均最高，凸显了其在生产损失和抗蠕虫药耐药性（anthelmintic resistance, AR）传播中的核心作用。这些发现为制定可持续的山羊寄生虫控制策略提供了具有全国代表性的证据。
研究背景与意义
胃肠道线虫感染是全球放牧反刍动物面临的主要健康挑战之一，不仅导致严重的经济损失，还制约了动物的福利与生产性能。在绵羊和山羊中，圆线虫是引发寄生虫性胃肠炎和生产损失的主要驱动因素。尽管绵羊和山羊感染的线虫种类大体相似，但山羊通常对圆线虫感染更为敏感，且往往承载更高的虫负荷，这在一定程度上归因于宿主物种特有的行为、生理和免疫学差异。因此，圆线虫感染在各类山羊生产系统中高度流行，并且由于抗蠕虫药耐药性（AR）的广泛出现而日益复杂化。
在澳大利亚，GINs被公认为影响山羊的最高优先级地方性病原体。生产者调查一致认为GINs是山羊健康和生产力的主要挑战。尽管澳大利亚奶山羊产业在不断扩张，但与绵羊和肉用山羊相比，关于奶山羊GINs患病率、感染强度、物种多样性和风险因素的当代数据仍然有限。现有的证据大多是从绵羊研究中推断得出的，或者源自昆士兰州、南澳大利亚州和新南威尔士州对野生山羊的机会性调查。虽然这些研究一致报告了GINs的高患病率，但它们受到样本量小、地理范围有限以及缺乏对家养山羊关注的制约。奶山羊由于其独特的生理学特征、免疫功能、泌乳和产奶量相关的管理实践，以及与羊驼、绵羊和/或牛混牧的普遍性，可能表现出与肉用山羊不同的流行病学模式。此外，由于牛奶休药期的要求，可用的驱虫药选择也较为有限。因此，迫切需要开展针对国内奶山羊的大规模分子监测研究。
为了填补这一知识空白，研究人员开展了一项全国性的横断面研究。该研究的主要目的是确定GINs的患病率，利用ITS2宏条形码技术识别圆线虫物种，并量化GINs的感染强度及其相关的流行病学风险因素。这项研究成果发表在了《Current Research in Parasitology》期刊上。
关键技术与方法
研究人员开展了一项全国性的横断面研究，样本来源于2023年11月至2024年7月期间澳大利亚六个州的68个注册奶山羊场的1028份个体山羊粪便样本。在实验室分析阶段，研究人员首先采用改良McMaster技术测定了粪便虫卵计数（FEC）。随后，利用针对核核糖体DNA第二内部转录间隔区（ITS2）的深度扩增子测序技术，对500份样本的DNA提取物进行了寄生虫物种鉴定。在生物信息学分析阶段，研究人员使用QIIME 2平台进行序列去噪和分类学注释，将扩增子序列变体（ASV）与nemabiome ITS2参考数据库进行比对。在统计学处理方面，研究人员应用线性混合效应模型来评估与FEC相关的风险因素，并使用定向无环图（DAG）来识别混杂变量，同时计算了组内相关系数（ICC）以评估牧群内的聚集效应。
研究结果
3.1 基于粪便虫卵计数的胃肠道线虫患病率
研究结果显示，GINs的调整后动物水平患病率为92%，牧群水平患病率为100%。其中，圆线虫的患病率最高，调整后动物水平患病率为91%，牧群水平为100%；其次为毛首线虫属（13%）和细颈线虫属（5%）。不同年龄组中，成年山羊的圆线虫患病率最高（96%），幼龄山羊最低（73%）。在不同气候带中，冬季降雨带的患病率最高（95%），地中海型气候带最低（83%），但各气候带间的差异未达统计学显著性。近期有驱虫史的山羊患病率显著高于无驱虫史的山羊。
3.2 胃肠道线虫的粪便虫卵计数强度
圆线虫FECs在不同个体间差异显著，范围从0到16710 EPG，中位数为480 EPG。数据显示，圆线虫FECs呈现高度的过度离散分布，方差均值比（VMR）高达2664，偏度为3.35。值得注意的是，30%的高排卵量山羊贡献了总排卵量的80%。中高强度的圆线虫排卵主要发生在成年母羊身上，且在位于冬季和非季节性降雨带的牧群中最为明显，特别是在夏季和秋季季节。相比之下，毛首线虫属和细颈线虫属的FEC结果普遍较低。
3.3 圆线虫粪便虫卵计数的风险因素
通过混合效应模型评估了15个候选风险因素，最终有四个因素与圆线虫FEC显著相关：年龄、气候带、驱虫史以及艾美耳球虫属合并感染。成年山羊的平均FEC最高，达到440 EPG，而幼龄山羊最低，为134 EPG。冬季降雨带的平均FEC最高，为444 EPG，显著高于地中海型气候带的136 EPG。近期有驱虫史的山羊平均FEC为113 EPG，高于无驱虫史的62 EPG。此外，合并感染艾美耳球虫属的山羊平均FEC为43 EPG，也显著高于未检测出球虫卵囊的山羊。
3.4 圆线虫物种的相对丰度与组成
对500份DNA样本的深度扩增子测序产生了约5100万条高质量读长，共鉴定出11个圆线虫物种，涵盖7个属。捻转血矛线虫在总读长中占比最高，达到50%，其次是蛇形毛圆线虫（37%）和环纹奥斯特线虫（8%）。这是首次通过ITS2宏条形码技术在浮选纯化的粪便虫卵DNA中检测到肺丝虫苗勒线虫（Muellerius capillaris）。在牧群水平上，圆线虫物种组成和相对丰度存在高度异质性，几乎所有牧群都检测到了混合感染，每个牧群的物种丰富度在2到6种之间。
3.5 山羊年龄、气候带和生物杀线虫剂使用对圆线虫物种相对丰度的影响
圆线虫物种的相对丰度因年龄组而异。捻转血矛线虫在幼龄山羊中的比例高于成年山羊，而蛇形毛圆线虫则相反。断奶山羊表现出最高的环纹奥斯特线虫相对丰度。在不同气候带中，冬季降雨带支持的物种丰富度最高，达到11种。夏季降雨带虽然物种数较少，但贡献了35%的总读长，主要由捻转血矛线虫和蛇形毛圆线虫主导。地中海型气候带中，蛇形毛圆线虫取代了捻转血矛线虫成为最优势物种。生物杀线虫剂的使用与否对物种相对丰度的影响较小。
3.6 个体动物和牧群水平的圆线虫物种患病率
在个体动物水平，捻转血矛线虫的调整后患病率最高，达到78%，其次是环纹奥斯特线虫（64%）和蛇形毛圆线虫（60%）。在牧群水平也观察到了类似的模式。年龄对某些特定物种的患病率有显著影响，例如捻转血矛线虫在幼龄山羊中患病率最高，而蛇形毛圆线虫和粗纹毛圆线虫则在成年山羊中更普遍。气候带同样影响了特定物种的分布，例如环纹奥斯特线虫和蛇形毛圆线虫在地中海型气候带的患病率最高。
3.7 圆线虫物种的合并感染
合并感染现象非常普遍，85%的山羊同时感染了2到8种圆线虫物种，平均每只动物携带3.0种。感染3种或4种圆线虫物种的情况最为频繁。单一感染相对少见，通常仅涉及环纹奥斯特线虫或捻转血矛线虫。
3.8 圆线虫物种的阿尔法多样性
阿尔法多样性在牧群间存在显著差异。在个体山羊水平，观察到的丰富度与年龄、气候带、圆线虫FEC强度和近期驱虫史显著相关。成年山羊的物种丰富度高于幼龄山羊。地中海型气候带的丰富度最高。随着FEC强度的增加，香农指数也随之上升。近期驱虫史是唯一与所有三个阿尔法多样性指标都相关的因素。
3.9 组内相关系数
研究估计，山羊圆线虫、细颈线虫属和毛首线虫属感染的ICC分别高达0.46、0.47和0.20，表明感染在牧群内部存在显著的聚集性。
讨论与结论总结
这项研究首次提供了澳大利亚奶山羊GINs患病率、感染强度、物种多样性及相关风险因素的全面评估。研究发现，圆线虫感染极为普遍，且FECs呈现高度过度离散分布，少数高排卵者造成了大部分牧场污染。成年山羊由于围产期免疫力下降，表现出最高的患病率和排卵强度。气候带虽不影响总体患病率，但对特定物种的组成有显著影响。研究强调了捻转血矛线虫在全国范围内的核心地位及其带来的抗药性风险。
综上所述，本研究表明澳大利亚奶山羊的GINs具有极高的患病率、多样性和感染负担。以捻转血矛线虫为主的圆线虫感染在各个牧群中广泛存在，甚至包括以往被认为低风险的区域，这凸显了在所有气候带实施主动寄生虫管理的必要性。圆线虫FECs显著的过度离散分布表明，牧场污染是由一小部分山羊驱动的，主要是成年母羊，这强调了在所有年龄组中进行常规FEC监测以识别高排卵者的重要性。鉴于捻转血矛线虫的广泛分布，基于FAMACHA指南的选择性治疗应成为控制计划的基石。此外，研究人员发现高FECs与关键的宿主、管理和环境因素之间的关联进一步证明了仅靠驱虫药的局限性。相反，综合性的寄生虫管理策略，包括结合选择性治疗、轮牧、生物防治、疫苗接种和营养干预，对于维持生产力并减缓AR的传播至关重要。总的来说，本研究为澳大利亚奶山羊GIN患病率提供了全面且最新的全国性流行病学证据。通过将经典寄生虫学方法与个体样本的下一代测序相结合，研究在动物和牧群水平上为圆线虫物种的丰度、多样性和患病率提供了高分辨率的见解，直接解决了与生产者、兽医和政策制定者相关的关键知识缺口。
