《Neurobiology of Stress》：Maternal separation increases anxiety-like phenotypes, fear responses, and alters Bdnf methylation in a predator odor exposure model of early life adversity
早期生活逆境（ELA）可增加日后精神病理学的发生率，部分是通过脑源性神经营养因子（Bdnf）基因的异常表达。ELA改变Bdnf表达的一种机制是通过DNA甲基化，这通常会降低表达。此前，本实验室利用了一种ELA的捕食者气味模型，即在出生后的前三周，母鼠（dams）与其幼崽（pups）暴露于合成狐狸粪便衍生物2,5-二氢-2,4,5-三甲基噻唑啉（TMT）或作为有害对照的丁酸（BTA）。发育期暴露于TMT降低了青春期对TMT的僵直反应，这表明照料者的存在可能缓冲了后期的恐惧反应。然而，照料者与单纯发育期暴露的贡献仍不清楚。在本研究中，幼崽在有或无母鼠在场的情况下，在出生后的前三周暴露于TMT或BTA。研究人员随后在关键发育时间点评估了TMT诱导的僵直反应、旷场实验中的一般焦虑样行为，并收集了内侧前额叶皮层（mPFC）、杏仁核和中脑导水管周围灰质（PAG）的脑组织，以评估Bdnf表达和DNA甲基化水平。结果表明，母鼠分离（MS）增加了雄性对TMT的僵直反应，降低了40 kHz超声波发声，增加了焦虑样行为，并以区域和年龄特异性的方式产生了Bdnf的表观遗传改变。总的来说，这些数据阐明了对照料环境的短暂干扰对大脑甲基化和行为的深远影响。此类数据有助于加深我们对ELA影响的神经生物学机制及其作为精神病理学潜在根本原因的理解。
母鼠分离在捕食者气味暴露的早期生活逆境模型中增加焦虑样表型、恐惧反应并改变Bdnf甲基化
早期生活逆境（Early Life Adversity, ELA）是指个体在发育早期经历的不利环境或应激事件，它对后代成年后的精神健康有着深远影响，与抑郁症、焦虑症等多种精神病理学的发病率增高密切相关。然而，并非所有经历ELA的个体都会发展出精神病理学，这表明存在调节因素。其中一个重要的调节因素是充足的亲代照料行为。在人类和啮齿动物中，良好的照料可以减轻ELA带来的生理、生物和行为后果，这一现象被称为“亲代缓冲”。先前的研究表明，母鼠通过抑制皮质酮分泌和调节杏仁核-前额叶神经环路来缓冲幼鼠的应激反应，且这种缓冲作用可能局限于出生后的某个关键发育窗口期。尽管母鼠缓冲的保护作用已得到广泛证实，但这些过程如何转化为大脑内持久的基因调控改变仍不完全清楚。啮齿动物模型是推动该领域研究的重要工具，例如可以操控早期照料环境。一种方法是在早期发育阶段让幼崽暴露于捕食者气味中。本实验室先前的研究发现，发育期暴露于狐狸粪便分子衍生物TMT能够增加母鼠的拱背哺乳姿势，并降低青春期幼鼠的僵直行为。然而，鉴于先前研究的设计，尚不清楚观察到的后代行为变化是由单纯的发育期气味暴露还是照料质量的变化所驱动，也不清楚大脑中哪些机制可能促成了这些行为改变。
表观遗传学（epigenetics），字面意思是“基因组之上”，研究遗传物质如何在不同的环境背景下被激活或抑制。早期关于母鼠照料差异的开创性研究首次证明，早期生活经历，特别是母鼠照料和应激暴露的差异，会在整个发育过程中产生持久的应激反应性和下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴功能的改变。这些基础性研究确立了早期环境条件可以对长期的生物和行为结果进行编程的原则，为后续的机制研究奠定了基础。此后，研究进一步将表观遗传过程，尤其是DNA甲基化（在胞嘧啶上添加甲基基团）确定为早期发育经历得以生物学嵌入的分子底物。表观遗传活性的改变，特别是DNA甲基化，持续被探索以帮助我们理解ELA如何导致病理性行为，以及照料环境如何具有保护作用。一个在发育过程中至关重要的基因是脑源性神经营养因子基因（Brain-derived neurotrophic factor gene, Bdnf），它广泛参与大脑发育和细胞存活、突触可塑性以及学习和记忆。在多个脑区和外周组织中，Bdnf的长期异常表达或DNA甲基化与ELA以及精神病理学发病率增加均有关联。特别是，照料行为缺陷已被证明会导致前额叶皮层（prefrontal cortex, PFC）中Bdnf的异常表观遗传活性，这被认为是抑郁症的生物标志物，并且这种异常甲基化对药物或行为治疗有反应。
本研究的首要目标是检验在TMT暴露期间母鼠缓冲对后代行为的作用。研究遵循了既往研究建立的暴露方法（持续至出生后第21天，PN21），尽管已知研究表明母鼠存在对有害刺激的缓冲能力在PN15后会下降。第二个目标是检验母鼠缓冲是否也会在后代中产生表观遗传改变。尽管甲基化通常是基因表达的关键上游调控因子，但研究首先检查了基因表达，然后检查了甲基化，以观察任何观察到的基因表达发现是否与甲基化发现一致。研究人员让幼鼠在出生后的前三周，在有或无母鼠在场（母鼠分离，maternal separation, MS）的情况下暴露于TMT或BTA。在青春期，测试幼鼠对TMT的僵直反应，并进行旷场实验以评估焦虑样行为。最后，收集整个大脑以评估前额叶皮层（PFC）、杏仁核和中脑导水管周围灰质（PAG）中的Bdnf表达和DNA甲基化水平，这些脑区都是已知受早期经历和照料影响的区域，并参与所检查行为的神经环路。
本研究使用的动物程序获得了特拉华大学动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。实验动物来源于从Charles River Laboratories获得的Long-Evans定时怀孕母鼠。在出生日（PN0），母鼠和幼崽未受干扰。在PN1，每窝幼崽被调整为数量相等的雄性和雌性（尽可能），每窝不超过12只（每窝4-8只雄性或雌性）。动物在PN21-23之间断奶，并与同一窝的同性配对饲养。每窝中，两只雄性和两只雌性被分配进行行为测试，两只雄性和两只雌性被分配用于PN22组织收集，两只雄性和两只雌性被分配用于PN30组织收集。每种性别在行为测试上的平均分被计算并用于统计分析。所有动物均饲养在透明的聚丙烯笼中，置于温控饲养室，维持12小时光照/黑暗周期（上午7点开灯），自由获取食物和水。每组（气味暴露×母鼠在场）有9-10窝用于行为测试分析。
从PN1-3开始，幼崽在有或无（母鼠分离，MS）母鼠在场的情况下，在出生后的前三周（PN1-21）暴露于丁酸（BTA）或TMT，每天20分钟，每周5天（周末不进行实验）。母鼠和幼崽最初被分配到四种条件之一：BTA、BTA-MS、TMT或TMT-MS。将有幼崽的母鼠或仅有幼崽（在MS条件下）连同其家庭笼被转移到通风橱中。母鼠在场的条件每天单独适应10分钟测试环境，然后进行20分钟的气味暴露。将液体样品TMT（总计300μmole，每条试纸150μmole/19.4 μl）或BTA（总计900μmole，每条试纸450μmole/39.6μl）滴在两条滤纸上，并固定在放置于家庭笼顶部的隔离器盖上。选择TMT的剂量是因为本实验室先前的工作表明该剂量在发育期具有显著的行为效应。由于已确定TMT的挥发性是BTA的三倍，因此给予相当剂量的BTA作为有害对照。在整个实验测试期间，白噪声机器设置为中等音量，播放瀑布声。
在20分钟的暴露期间，记录母鼠行为（舔舐/梳理和拱背哺乳，ABN），并连续评分6次（总共15次暴露中的6次，分别在每一发育周两次），仅针对有母鼠在场的组别。由两名训练有素的观察者对这大部分子集进行评分，每个视频文件的评分取平均值。所有评分者间信度均使用皮尔逊R进行分析，行为评分在观察者之间的相关系数均> 0.85。使用Batbox III D, UK收集幼鼠40 kHz超声波发声（USV），与视频记录同时收集（在有或无母鼠在场组）。发声以1分钟时间窗进行评分，数据来自检查母鼠行为的相同6次暴露。40 kHz USV由两名训练有素的观察者评分，每个文件的评分取平均值并计算为百分比。评分者间信度使用皮尔逊R分析，评分者之间的相关系数为r = .81。
从PN28-29开始，幼崽被转移到测试室，在测试条件下（室灯关闭；通风橱灯开启）每天处理5分钟。在PN30，所有受试者接受对TMT（总计100μmole，每条试纸50μmole/6.50μl）的行为反应测试，持续10分钟。此期间的所有行为测试均在四个圆柱形有机玻璃室（直径8.6厘米；长度20.0厘米）中进行。TMT液体样品固定在滤纸上并放置在室内的插入物上，该插入物将受试者限制在室内，并防止其看到同时测试的其他受试者。僵直行为通过视频记录仪捕捉并传输到戴尔计算机，使用FreezeFrame软件（Actimetrics, Wilmette, IL）设置为四室模式以3.75帧/秒录制，并通过FreezeView软件（Actimetrics）量化。为每只动物手动设置个体运动阈值，僵直被定义为除了呼吸外停止所有运动持续1秒或更长时间。TMT暴露后，动物被留下通风10分钟，然后返回饲养室，动物之间用70%乙醇溶液擦拭室室。计算每只动物在10分钟测试期间的平均僵直百分比。为了确定体重是否与僵直相关，所有动物在测试前称重。
从PN33-PN34开始，幼崽被转移到旷场测试室，不受干扰地停留10分钟以适应测试条件。在PN35，将动物放置在圆形旷场竞技场（高：20.3厘米 x 直径：40.6厘米 x 周长：127厘米）中，自由探索10分钟。所有动物在红光照明下进行测试，白噪声机器（HoMedics Sound Spa Sound Machine）设置为中等音量，整个测试期间持续播放。所有旷场测试均在上午（早上7点至中午12点）进行。使用Sony Handcam录制中心进入次数、直立次数、周边穿线次数和在中心区域停留的持续时间，随后由两名训练有素的观察者评分。对于所有测量，评分者间信度使用皮尔逊R分析，每种行为的评分者间相关系数r > 0.75。当动物的前肢越过竞技场标记的子区域时计为穿线，当动物用后腿站立时计为直立行为，当动物将前肢放在竞技场中心的独立圆形子区域时计为中心进入/停留。
为了评估发育期气味暴露后的即时表观遗传后果以及表观基因组改变的稳定性，在PN22和PN30，牺牲了一部分未接受青春期行为测试的同窝仔鼠（每窝2只雄性和2只雌性，如果有的话）。在每个时间点，从每窝随机选择1只雄性和1只雌性进行生化分析。整个大脑被速冻并储存于-80°C直至后续处理。在冷冻切片机（Leica Biosystems）中，于-13°C将大脑以100μm厚度切片，使用大鼠图谱（Paxinos & Watson, 2007）的坐标解剖出杏仁核、中脑导水管周围灰质（PAG）和内侧前额叶皮层（mPFC）。这些组织储存于-80°C以待后续处理。
使用Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini试剂盒从杏仁核和内侧前额叶皮层提取DNA和RNA，核酸的数量和质量通过分光光度法（NanoDrop 2000）分析。PAG的DNA和RNA使用Qiagen AllPrep DNA/RNA Micro试剂盒提取，因为组织体积较少。DNA和RNA储存于-80°C，冻融循环保持在最低限度。然后使用cDNA合成试剂盒（Qiagen Quantitect Reverse Transcription Kit）按照制造商说明对RNA进行逆转录处理。使用TaqMan探针（Thermo Fisher Life Technologies）对cDNA进行实时PCR（Bio-rad CFX96）。对于每个目标基因，使用Tubulin作为参考基因，所有PCR反应均进行三份。取每份三份的平均CQ值。使用2?ΔΔCT方法计算目标基因的基因表达。
为了量化每个基因靶点的甲基化水平，使用Qiagen Epitect Bisulfite试剂盒对DNA进行亚硫酸盐转化，并储存于?20°C。使用甲基化特异性实时PCR（MSP；Bio-Rad CFX96）确定每个基因靶点的甲基化水平。对于每个目标基因，使用Tubulin作为参考基因，所有PCR反应均进行三份。取每份三份的平均CQ值。使用2?ΔΔCT方法计算目标基因的甲基化。使用的Bdnf探针和引物基于本实验室先前使用的序列。
所有统计分析均使用GraphPad Prism 9进行。对于行为测量，尽可能将2只雄性和2只雌性的数据分别取平均，每个分数代表每窝的雄性和雌性值。母鼠行为（俯身/哺乳和拱背哺乳所占百分比时间）的分析采用双向混合方差分析（气味暴露×观察期）。40 kHz发声采用三向混合方差分析（母鼠在场×气味暴露×观察期）。对于每个混合方差分析，均不假设球形度，并应用Geisser-Greenhouse（ε < .75）或Hyun-Feldt（ε > .75）校正。对TMT的僵直反应、体重和所有旷场测量均采用三向方差分析（性别×气味暴露×母鼠在场），随后根据需要进行双向方差分析。事后检验采用Bonferroni多重比较检验作为α校正方法。所有统计分析的显著性水平设为p < .05。使用Grubb’s检验（α = .05）或ROUT分析（Q = 1%）分析异常值。所有基因表达和甲基化数据均采用三向方差分析（性别×母鼠在场×气味暴露），随后根据需要进行双向方差分析。事后检验采用Bonferroni或Tukey多重比较检验作为α校正方法。所有统计分析的显著性水平设为p < .05。使用Grubb’s检验（α = .05）或ROUT分析（Q = 1%）分析异常值。
对于每个混合方差分析，均不假设球形度，并应用Geisser-Greenhouse（ε < .75）或Hyun-Feldt（ε > .75）校正。一项考察气味暴露在六个观察期对舔舐/梳理影响的双向混合方差分析显示，观察期无显著影响，F(3.36,60.49) = 1.67, p = .18，气味暴露无显著影响，F(1,18) = .30, p = .59，且无显著交互作用，F(5,90) = 1.76, p = .13（图1a）。同样，考察气味暴露在六个观察期对拱背哺乳（ABN）影响的双向方差分析显示，气味暴露无显著影响，F(1,18) = 1.0, p = .33，时间×气味暴露交互作用不显著，F(5,90) = 2.01, p = .07（图1b）。然而，观察期存在显著的主效应，F(3.88,69.91) = 3.61, p = .01，表明所有母鼠在观察期间都减少了ABN。
为阐明发育期气味暴露或母鼠在场是否影响幼崽40 kHz发声，进行了一项考察母鼠在场、气味暴露和观察期对幼崽40 kHz超声发声影响的三向方差分析。结果表明观察期×母鼠在场交互作用显著，F(5,175) = 6.26, p <.0001，以及时间×母鼠在场×气味暴露三向交互作用显著，F(5,175) = 3.28, p = .0074（图2）。事后分析显示，无论气味暴露如何，没有母鼠在场的幼崽在多个观察期表现出40 kHz发声的显著减少。具体而言，在观察期1（p < .0001）和6（p = .02），经历母鼠分离（MS）的动物相比有母鼠在场的动物，其40 kHz发声显著降低（p = .02）。
一项考察性别、母鼠在场和发育期气味暴露对PN30对TMT僵直反应影响的三向方差分析显示，性别×母鼠在场交互作用显著，F(1,72) = 6.15, p = .02（图3a）。事后分析合并幼崽气味暴露因素发现，雄性，而非雌性，经历整个发育期MS的雄性相比有母鼠在场的雄性，在PN30对TMT的僵直反应显著增加（p = .03）。这些数据共同表明，在我们的范式中，雄性和雌性对TMT的反应因MS而表现出行为差异。
一项考察性别、母鼠在场和发育期气味暴露对PN30体重影响的三向方差分析显示，存在显著的性别主效应，F(1,147) = 62.22, p <.0001，雄性显著重于雌性。气味暴露也存在主效应，F(1,147) = 16.06, p < .0001，发育期暴露于TMT的动物体重高于暴露于BTA的动物。为了评估体重是否显著预测PN30对TMT的僵直反应并作为一个混杂因素，进行了使用皮尔逊R的体重与对TMT僵直反应的相关性分析。结果表明体重与僵直水平无显著相关性，r(141) = .06, p = .50。这些数据表明观察到的僵直差异并非由于体重的波动所致。最后，为阐明观察到的僵直差异是否部分归因于性别对气味剂敏感性的差异，对BTA-MS组的一个动物子集测试了对BTA（总计900μmole）、发育暴露剂量TMT（总计300μmole）和实验僵直剂量TMT（总计100μmole）的僵直反应。双向混合方差分析（性别×连续气味剂递送）显示气味剂类型/剂量存在主效应，F(1.92, 26.94) = 38.95, p < .0001，但性别主效应不显著，F(1,14) = .26, p = .61，且无性别×气味剂交互作用，F(2,28) = .08, p = .92。事后分析显示，暴露于100μmole和300μmole TMT的动物相比暴露于900μmole BTA的动物，其僵直反应显著增加（p = .04 和 p < .0001）。此外，暴露于300μmole TMT相比暴露于100μmole TMT也引发了显著更多的僵直发作（p < .0001）。这些结果复制了本实验室先前发现的TMT剂量-反应关系，进一步表明先前观察到的僵直差异并非由于性别相关的气味敏感性本身所致。总之，数据表明MS以性别特异性的方式影响后期对TMT的恐惧反应，且不受体重差异或TMT相关恐惧反应的性别差异的影响。
为检验是否存在一般焦虑样行为的差异，分别对旷场实验中的周边穿线次数、直立行为、中心停留时间和中心进入次数进行了考察性别、母鼠在场和发育期气味暴露影响的三向方差分析。关于一般运动行为，存在显著的性别主效应，F(1,71) = 12.94, p = .0006，雌性的周边穿线次数显著多于雄性（图4a）。同样，直立行为也存在显著的性别主效应，雌性在此范式中的直立次数显著多于雄性（p = .03）（图4b）。母鼠在场或发育期气味暴露对周边穿线次数或直立次数没有影响。关于焦虑样行为指标，性别主效应不显著，F(1,71) = .79, p = .38，发育期气味暴露效应也不显著，F(1,71) = 1.32, p = .25（图4c）。然而，母鼠在场存在显著的主效应，F(1,71) = 6.61, p = .012，经历MS的动物中心进入次数显著少于母鼠在场的动物。同样，母鼠在场对动物在中心停留时间也存在显著主效应，F(1,71) = 9.46, p = .003，经历MS的动物在中心停留时间显著短于范式中有母鼠在场的动物（图4d）。发育期气味暴露效应不显著，F(1,71) = .41, p = .52，性别效应也不显著，F(1,71) = 1.07, p = .30。总之，这些数据表明，经历整个三周范式中短暂MS的雄性和雌性，与没有MS的幼崽相比，后期在旷场实验中表现出焦虑样行为。
为阐明观察到的焦虑和恐惧样表型是否与异常的Bdnf活性有关，在范式结束后PN22收集了mPFC、杏仁核和PAG的DNA和RNA。所有组织均收集自未接受行为测试的动物子集中。在所有组织中，Bdnf活性、DNA和RNA均无性别差异。因此，数据按性别合并，并进行了双向方差分析（母鼠在场×发育期气味暴露）。在mPFC中，未观察到与发育期TMT暴露相关的影响（图5a）。然而，观察到母鼠在场的主效应显著，F(1,63) = 20.31, p < .0001，经历MS的动物Bdnf Exon IX表达显著低于母鼠在场的动物。在杏仁核中，气味暴露主效应显著，F(1,67) = 14.53, p = .0003，TMT暴露动物Bdnf Exon IX表达显著低于BTA暴露动物（图5b）。此外，母鼠在场主效应显著，F(1,67) = 9.22, p = .0034，经历MS的动物Bdnf Exon IX表达显著低于范式中有母鼠在场的动物。在PAG中，观察到母鼠可用性与气味暴露之间存在显著交互作用，F(1,61) = 7.27, p = .003（图5c）。使用Tukey校正方法的事后检验显示，BTA-MS组动物的表达高于BTA组动物（p = 0.04）。总之，基因表达数据表明MS驱动了mPFC和杏仁核中Bdnf基因表达的降低，而TMT暴露足以降低杏仁核中的表达。在PAG中，影响更为复杂，暴露于BTA并经历MS的动物表现出基因表达增加。
鉴于DNA甲基化是驱动基因表达变化的常见机制，研究人员接下来想看看我们的基因表达发现是否与Bdnf Exon IX的DNA甲基化差异平行。同样，未观察到性别效应，因此所有数据按性别合并，并进行了双向方差分析（母鼠在场×发育期气味暴露）。在mPFC中，观察到MS的显著影响，MS显著降低了Bdnf Exon IX甲基化，与有母鼠在场的动物相比（图5d）。在杏仁核中，同样观察到母鼠在场的主效应显著，F(1,74) = 4.51, p = .037，经历MS的动物甲基化显著降低（图5e）。在PAG中，一项考察气味剂和母鼠可用性对甲基化影响的双向方差分析显示存在显著的双向交互作用，F(1,62) = 11.32, p = 0.0013（图5f）。使用Tukey方法的事后检验显示，BTA-MS组动物的甲基化显著低于BTA组动物（p=0.0049）。这些数据大体上符合DNA甲基化增加通常伴随基因表达降低的观念。
研究人员接下来想看看观察到的表观遗传改变是否随时间稳定，直至与进行焦虑样行为测量的旷场实验相匹配的时间点。在PN30，取出整个大脑并速冻，从mPFC、杏仁核和PAG提取RNA和DNA用于表达分析。所有组织均收集自未接受行为测试的动物子集中。与PN22数据类似，未观察到性别差异，因此所有数据按性别合并，并进行了双向方差分析（母鼠在场×发育期气味暴露）。在mPFC中，母鼠在场存在主效应，F(1,70) = 4.35, p = .04，MS组动物Bdnf Exon IX表达显著高于范式中有母鼠在场的动物（图6a）。这些发现与PN22数据直接相反，表明mPFC中的Bdnf Exon IX表达水平在MS后立即下降，但在PN30时恢复到与对照动物相当的水平。在杏仁核中，观察到幼崽气味暴露的主效应显著，F(1,73) = 4.72, p = .033，暴露于TMT（M = 1.32, SD = 0.72）的动物Bdnf Exon IX表达显著高于BTA动物（M = 1.02, SD = 0.48）（图6b）。与mPFC中的发现类似，杏仁核中的这些数据与PN22动物的数据直接相反，这表明在范式结束后Bdnf Exon IX表达立即降低，随后在PN30时相比对照动物有所增加。在PAG中，一项考察气味剂和母鼠在场对基因表达影响的双向方差分析显示气味剂存在主效应，F(1,67)= 9.79, p =0.0026，暴露于TMT组的表达显著低于暴露于BTA的组（图6c）。此外，母鼠在场也存在主效应，F(1,67) = 7.726, p =.0041，母鼠分离组的表达显著低于有母鼠在场的组。总之，数据表明，在PN22观察到的基因表达早期变化在所分析的脑区中大多是短暂的。
最后，研究人员检查了PN30基因表达的任何变化是否与Bdnf Exon IX DNA甲基化的任何变化一致。在mPFC中，观察到幼崽气味暴露×母鼠在场存在显著交互作用，F(1,66) = 14.97, p = .0003（图6d）。使用Tukey α校正方法的事后检验显示，TMT组动物的甲基化显著高于BTA组（p < .0001）、BTA-MS组（p = .0162）和TMT-MS组（p = .0046）。此外，TMT暴露组动物相比BTA暴露动物甲基化显著更高，F(1,71) = 11.05, p = .0014。鉴于DNA甲基化增加通常（尽管不是绝对地）伴随表达降低，这些数据部分与先前观察到的表达发现一致，即TMT组在mPFC中具有更高的甲基化和更低的Bdnf Exon IX表达。此外，发育期TMT暴露增加mPFC中Bdnf Exon IX甲基化的作用直到这个较晚的时间点才显现，这表明早期生活经历可能在该基因座产生延迟的表观遗传后果。
在杏仁核中，观察到幼崽气味暴露×母鼠在场存在显著交互作用，F(1,67) = 5.76, p = .0192（图6e）。随后对双向交互作用应用Tukey事后α校正标准进行所有成对比较。事后结果表明，TMT-MS组动物的甲基化显著高于BTA组（p < .0001）、BTA-MS组（p = .0005）和TMT组（p < .0001）。这些数据表明该基因座的甲基化水平作为所经历环境条件的函数而变化。在PAG中，一项考察气味剂和母鼠在场对Bdnf exon IX甲基化影响的双向方差分析显示存在显著的双向交互作用，F(1,73) = 5.53, p = 0.02（图6f）。使用Tukey校正方法的事后检验显示，TMT-MS组动物的甲基化高于TMT组（p =0.0451）和BTA-MS组（p =0.012）。TMT-MS组与BTA组相比甲基化增加无统计学显著性（p = 0.0603）。鉴于TMT-MS组表现出最大的表达降低和观察到的最高甲基化，正如先前对PN22数据得出的结论一样，PAG中的甲基化可能与观察到的基因表达变化有关。
总之，与PN22数据类似，可能并非甲基化驱动了mPFC和杏仁核中观察到的基因表达变化。然而，PAG的数据表明DNA甲基化是一个值得进一步研究的可能机制。未来的工作当然有必要确定甲基化和基因表达数据之间的任何因果关系。
本研究有几个主要发现值得指出。首先，研究显示，虽然发育期暴露于TMT并未改变母鼠对后代的照料行为，但MS在特定时间点降低了幼鼠40 kHz发声。其次，研究人员报告，经历母鼠分离的雄性，而非雌性，在PN30对TMT的僵直反应增加，这与发育期的气味暴露无关。这并非由于性别对气味剂敏感性的差异或体重的变化所致。第三，研究人员观察到作为MS功能的旷场实验中焦虑样行为增加。最后，研究人员观察到在mPFC、杏仁核和PAG中Bdnf表达和甲基化的时间依赖性变化。
在行为方面，研究人员没有观察到TMT改变拱背哺乳行为的能力。在先前的工作中，研究人员观察到了一个短暂效应，即在TMT暴露的前半段ABN显著较高，而在后半段显著降低。在这里，在最后一个观察期6确实看到ABN行为减少，但根据方差分析分析，这并非显著结果。结果不一致的一个可能性是，特定的暴露日可能特别重要。其他人测量母鼠在捕食者气味存在下母鼠行为的工作也记录了母鼠行为在特定暴露日之间的变异性，与此观点一致。因此，限制我们进行完全全面比较的一个局限是，为了避免周末测试，暴露发生在PN 1-21之间略有变化的日子里。虽然所有幼崽接受了相同总数的暴露，但并非每只幼崽都在完全相同的出生后日子暴露。不同的发现表明，暴露的特定出生后日子可能是解释我们跨研究结果时需要考虑的重要变量。未来的研究应寻求找到ELA（以捕食者气味形式）对后代产生持久行为和分子后果的关键窗口期。
尽管TMT没有影响母鼠行为，但研究人员发现MS足以有效干扰幼鼠行为。具体而言，与有母鼠在场的幼崽相比，与母鼠分离的幼崽在早期和晚期观察期发出的40 kHz USV都较少。其他研究报告了通过操纵照料环境引起的USV变化，MS会增加40 kHz发声，或者虐待也会增加。额外的工作表明，在MS期间USV频率发生转变，且在应激经历中存在约40kHz和约60kHz发声的共现。在本研究中，研究人员复制了先前的发现，即TMT暴露增加了僵直行为，表明这种气味剂确实会产生强大而固有的僵直反应。研究人员还发现，经历MS的雄性相比有母鼠在场的雄性，对TMT的僵直反应增强，而雌性没有观察到类似差异。此外，研究人员报告这种性别差异并非由于检测气味剂的敏感性或体重差异所致，这表明差异可能部分归因于母鼠可用性或性激素的差异。这与先前的工作一致，表明母鼠在应激下可能为雄性和雌性幼崽提供不同的照料，这可以影响后代的应激反应性和行为结果。因此，MS可能对雄性和雌性产生不同的影响，因为每个性别可能不同程度地依赖母鼠行为进行生理应激调节。最后，鉴于最近已确定单独的MS可能诱导母鼠的行为改变，尚不清楚母鼠行为如何随MS和后代的性别而变化。未来的研究应寻求建立和进一步细化ELA背景下来自母鼠的性别特异性相互作用。
研究人员还发现，发育期暴露于TMT，而非MS，增加了PN30测量的体重。鉴于在测试期间未观察到母鼠照料的差异，有几个可能的解释值得考虑。首先，有可能暴露于TMT的母鼠在形态学测试结束后返回饲养室时增加了母鼠照料，本实验室先前报告TMT暴露会增加母鼠照料。其次，据报道，特定的发育期应激源可以塑造代谢和神经内分泌信号，导致体重增加。在本研究中，无法确定体重是在断奶前还是断奶后增加的，未来的工作应探讨特定类型的应激源如何影响饮食、代谢和HPA轴调节。
在旷场实验中，研究人员观察到，作为母鼠分离（MS）的功能，雄性和雌性都表现出一般焦虑样行为增加，而发育期TMT暴露没有行为后果。值得注意的是，文献中的MS方案具有高度异质性，且雄性更常被研究，使得研究间的直接比较变得困难。例如，虽然一些研究报告MS诱导雄性和雌性焦虑样表型增加，但其他研究报告这种表型仅在雄性中出现，还有一些研究报告雌性焦虑样行为减少而雄性没有，或者行为没有变化。短暂的MS似乎足以改变雄性的某些行为领域，而更长或更重复的MS可能需要在雌性中产生类似效果。尽管如此，我们的数据表明，即使是短暂的MS也足以在两性中诱导一般的焦虑样表型。
除了行为后果，研究人员还发现了MS或TMT暴露的表观遗传后果，这些后果取决于所检查的年龄和脑区。基因表达和甲基化效应因发育时间、母鼠可用性和脑区而异。瞬时和后期出现的，以及脑区依赖性的表观遗传后果，与本实验室另一条研究早期逆境在照料背景下影响的观察结果一致。
在PN22，mPFC中MS导致范式结束后Bdnf exon IX表达立即降低。类似的研究表明，在前三周每天进行三小时的MS范式在PN7和PN10瞬时降低了mPFC中的Bdnf exon IX表达，在PN14未观察到差异，在PN21观察到边缘性降低。作为重复MS结果的Bdnf表达的瞬时降低对mPFC中的GABA能神经元发育产生了深远影响，这可能在焦虑样行为的发病机制中发挥作用，因为mPFC已知通过基于GABA水平的杏仁核相互连接部分抑制恐惧反应。此外，其他研究报告每天3或4小时，从PN1-21的MS在后期青春期发育中降低了mPFC中的Bdnf表达或蛋白水平，MS进一步与诱导焦虑样表型相关，并且行为变化与Bdnf表达的降低有关。
同样，在杏仁核的PN22，作为MS或TMT发育暴露的功能，研究人员报告范式结束后Bdnf exon IX表达立即降低。虽然关于MS相关杏仁核Bdnf表达变化的研究很少，但一项研究发现，PN8-21期间每天3小时的MS足以在成年期瞬时增加杏仁核中的基础BDNF蛋白水平，在暴露于急性应激后恢复到正常水平，这表明测量窗口可能至关重要。尽管如此，在杏仁核中，BDNF的降低与焦虑症和受损的前额叶-杏仁核连接有关，异常的Bdnf表达与焦虑和抑郁等精神病理学有关。
研究人员还报告，在PN22，MS足以降低mPFC和杏仁核中的Bdnf DNA甲基化。考虑到观察到的基因表达降低，这有点令人惊讶，因为甲基化通常（尽管不是排他性地）降低基因表达。然而，外显子DNA甲基化水平较低与基因表达水平较低之间的关联已在其他研究中被记录。不一致也可能归因于其他Bdnf基因座起作用或其他未测量的表观遗传机制。确实，虽然DNA甲基化是改变基因表达的最常见机制，但其他机制可能驱动观察到的异常Bdnf表达。本研究未测量的、值得进一步探索的机制包括组蛋白修饰、乙酰化、类泛素化和磷酸化，以及表观遗传调控因子如甲基CpG结合蛋白2或组蛋白去乙酰化酶，它们可以进一步募集共激活因子或共抑制蛋白。其他调节层也可能导致观察到的作为应激功能的表达模式，包括外显子特异性转录、转录后调控以及前体BDNF（proBDNF）与成熟BDNF（mature BDNF）的差异加工。将这些机制纳入未来的研究可能有助于澄清我们数据中观察到的甲基化和表达变化之间的关系。尽管基因表达和甲基化数据之间预期的方向性变化不一致，但表观遗传变化与文献一致，证明了甲基化对早期生活经历的非凡敏感性。
在PN30，MS动物在mPFC和杏仁核中均观察到Bdnf表达增加，这与焦虑样表型相符。杏仁核中Bdnf表达增加已在各种成人应激范式中观察到，包括社会挫败和与焦虑样行为相关的慢性束缚应激。然而，在与焦虑表型相关的杏仁核中，Bdnf表达的增加或减少存在深刻的异质性，这取决于发育期和实施的特定应激范式。如前所述，一项研究发现，暴露于PN8-21每天3小时MS的动物表现出增加的基础BDNF蛋白水平，在经历环境应激后恢复正常，强调了测量基因表达的时间依赖性敏感性。同样，应激与PFC中Bdnf表达之间的关系也存在异质性，多种应激源后的表达水平存在时间依赖性波动。实际上，另一项最新研究甚至提出，应激源的类型可能导致大脑中甲基化水平的差异。总之，研究人员的瞬时效应并非特别令人惊讶，这突显了表观基因组对特定时间依赖性环境条件的可塑性。
虽然研究人员在PN22的mPFC和杏仁核中看到MS导致甲基化水平较低，但在PN30甲基化水平较高。增加的水平伴随着基因表达的增加。有趣的是，与PN22数据类似，甲基化与基因表达的变化方向相同。研究人员还在PN30的mPFC中报告，TMT组相比所有其他组具有更高的Bdnf Exon IX甲基化。这些Bdnf甲基化数据部分符合预期，因为PN30时有母鼠在场的组相比MS动物表现出Bdnf表达降低。
最后，研究人员报告了ELA对PAG表观遗传活性的新发现。具体而言，在PN22，研究人员发现BTA-MS组Bdnf表达增加，这与甲基化降低一致。在PN30，研究人员发现作为MS和TMT暴露功能的Bdnf表达降低，这与TMT-MS组甲基化增加一致。鉴于观察到的僵直行为差异以及已知PAG在调节僵直与逃跑防御反应中的作用，这些数据表明PAG可能是一个容易受到表观遗传影响的区域，这些影响可以调控防御反应。未来的工作应考虑PAG中的Bdnf活性作为理解早期环境对防御行为影响的重要靶点。
本研究有几个局限性。首先，研究人员只探索了一种潜在的表观遗传机制，未来寻求MS诱导的Bdnf表达和行为变化机制解释的研究应考虑更广泛的机制筛选。其次，更彻底地分析整个暴露期间的母鼠行为将为TMT改变母鼠行为的能力和可靠性提供进一步见解。第三，研究人员只包括了两个时间点收集脑组织。正如研究人员的数据和其他人的数据所示，基因表达和甲基化存在时间依赖性波动，包含多个时间点的研究有望提供对环境与大脑发育及其在行为结果出现中作用的动态互动的最佳理解。事实上，由于使用独立而非重复测量的分子取样，研究人员无法确定早期生活逆境（ELA）如何与这些分子特征在发育过程中相互作用。第四，研究人员只包括了一个相对对照条件（BTA），而不是真正的初始对照（水），这限制了研究人员区分可能源于BTA轻微有害特性的基线差异的能力。
尽管有局限性，本研究进一步深入了解了早期出生后环境塑造后期行为和表观遗传活性的能力。研究人员提供的证据表明，短暂的MS足以以性别特异性的方式影响后期的焦虑样和恐惧行为，这些早期分离对多个与焦虑和恐惧相关反应相关的脑区的表观遗传活性有可测量的影响。观察到的基因表达与DNA甲基化之间的关系突显了Bdnf调控的复杂性，这可能涉及多种机制，包括外显子特异性转录、转录后调控以及前体BDNF（proBDNF）与成熟BDNF（mature BDNF）的差异加工，表明存在多层控制，对早期环境经历动态响应。尽管本研究未直接评估跨代效应，但观察到的表观遗传修饰提出了一些变化可能具有适应性或保护功能的可能性，而不仅仅是风险标志物。未来研究纵向和跨代结果的工作可以进一步阐明早期生活经历如何影响发育过程中的表观遗传编程和行为表型。
