基于青春期乙醇暴露重编程雄性成年期乙醇挑战中的HMGB1反应性

《Physiology & Behavior》：Adolescent Ethanol Exposure Reprograms HMGB1 Responsivity to Adult Ethanol Challenge in Males

　　

研究人员采用了一种模拟人类青少年间歇性暴饮的啮齿类模型——青春期间歇性乙醇（Adolescent Intermittent Ethanol, AIE）暴露（每日5克/千克乙醇或水，经口灌胃，采用2天给药/2天戒断的周期，从出生后第25天持续至第54天），以评估雄性Wistar大鼠在成年期（出生后第105-110天）对急性乙醇挑战（4克/千克）的免疫、神经元及内分泌反应性的紊乱情况。研究发现，急性乙醇挑战增加了对照组大鼠的血浆高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1, HMGB1）水平，而AIE暴露则钝化了这种反应，且未改变基础血浆HMGB1水平。此外，AIE暴露持续升高了血浆丙氨酸氨基转移酶（Alanine Aminotransferase, ALT）水平，表明存在持续的肝脏损伤。乙醇诱导的血浆皮质酮反应是完整的，这表明在AIE之后，机体对后续乙醇挑战的先天免疫与内分泌反应出现了分离。在大脑中，AIE产生了区域特异性的HMGB1免疫反应性（immunoreactivity, IR）改变：增加了齿状回中的HMGB1+IR，但降低了CA3和CA1区的HMGB1+IR。急性乙醇挑战仅在对照组动物中降低了海马HMGB1+IR，表明AIE导致了对乙醇诱导的海马结构HMGB1细胞外排产生持久耐受。AIE还增加了齿状回和基底外侧杏仁核（basolateral amygdala, BLA）中的环氧合酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）+IR，并且个体间的HMGB1与COX-2+IR表达存在相关性。在BLA，成年期急性乙醇挑战选择性地增加了对照组动物的COX-2表达。总之，这些数据表明，AIE产生了持久的、区域和分子靶标特异性的乙醇反应性重编程，这种重编程在先天免疫、神经元和内分泌领域中差异性地显现。

本研究旨在阐明青春期乙醇暴露如何导致成年期对酒精使用障碍（alcohol use disorder, AUD）的持续易感性。青少年期是一个关键的发育窗口，其特征是神经、内分泌、免疫和行为系统的快速成熟。在此期间，风险寻求行为增加，与人类开始进行娱乐性药物使用（包括暴饮）相吻合。流行病学研究一致表明，青少年期较早开始饮酒会增加成年后发展为AUD的可能性。青春期间歇性乙醇（AIE）模型作为人类青少年暴饮的模拟，已揭示出AIE会导致成年期持久的神经免疫适应，包括持久的行为改变（如乙醇消费增加、行为耐受、焦虑样表型以及海马依赖性学习和逆转学习障碍）和免疫反应失调。先前研究发现，AIE能在无刺激的成年大脑中上调多种先天免疫信号，如高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、环氧合酶-2（COX-2）、C-C基序趋化因子配体2（CCL2）、晚期糖基化终产物受体（RAGE）以及磷酸化核因子κB（NF-κB）p65。HMGB1是一种高度保守的核非组蛋白蛋白，可作为损伤相关分子模式（damage-associated molecular pattern, DAMP）在乙醇暴露后从细胞核转位并释放到细胞外空间。酒精使用障碍患者的血浆、肝脏和尸检脑组织中均发现HMGB1水平升高，且与饮酒起始年龄、使用时长及AUD临床严重程度相关。尽管AIE模型表明HMGB1信号可能对免疫青春期重编程特别敏感，但之前没有研究考察急性乙醇暴露如何影响体内的HMGB1，或AIE史是否会改变这种反应。因此，本研究利用大鼠AIE模型结合成年期急性乙醇挑战，旨在确定青春期乙醇暴露如何塑造成年期持久且区域特异性的HMGB1表达和乙醇反应性，并特别关注海马和杏仁核回路。同时，研究人员也考察了外周HMGB1、皮质酮（内分泌反应）和ALT（肝功能）对AIE及急性乙醇挑战的反应性变化，以判断这些改变是局限于大脑还是反映了更广泛的系统性适应。此外，鉴于HMGB1在先天免疫级联中很少孤立作用，研究进一步评估了AIE和急性乙醇后HMGB1表达变化是否与海马中其他先前证实被AIE上调的先天免疫信号（特别是COX-2）相关联。最后，为测试先天免疫信号的变化是否与神经元可塑性相关基因的表达相关，研究人员检验了这些由HMGB1和COX-2驱动的脑部变化是否与即刻早期基因活动调节细胞骨架相关蛋白（activity-regulated cytoskeleton-associated protein, Arc）的表达变化平行。本研究的发现揭示了AIE如何通过重编程先天免疫、神经元和内分泌系统的反应性来增加成年期AUD易感性的重要机制，为理解神经免疫和神经可塑性相关信号如何导致长期AUD风险提供了新见解。该研究发表在《Physiology》期刊上。研究人员主要使用了以下关键技术方法：采用青春期间歇性乙醇（AIE）暴露模型（PND 25-54，5克/千克/天，口服灌胃，2天给药/2天戒断周期）；在成年期（PND 105-110）进行急性乙醇挑战（4克/千克，口服灌胃）；通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血浆HMGB1、ALT、皮质酮水平；采用免疫组织化学和免疫荧光技术，结合改进的无偏体视学方法，定量分析多个脑区（包括海马齿状回、CA3、CA1，以及基底外侧杏仁核BLA和中央杏仁核CeA）的HMGB1、COX-2和Arc的表达；利用腺相关病毒（AAV）载体在海马过表达带FLAG标签的HMGB1蛋白，以区分细胞释放与基因转录变化；并进行相关性分析。研究结果如下：首先，在血浆标志物方面，研究发现，与成年期接受水处理的对照组相比，有AIE史的大鼠在成年期接受急性乙醇挑战后，血浆乙醇浓度（Blood Ethanol Content, BEC）出现显著但轻微的降低。然而，急性乙醇挑战均显著升高了两组大鼠的血浆皮质酮水平，且AIE史并未影响这一内分泌反应。关键的是，急性乙醇挑战显著增加了无乙醇暴露史对照组大鼠的血浆HMGB1水平，但未能引起AIE组大鼠血浆HMGB1的升高，表明AIE诱导了对后期乙醇暴露的HMGB1反应持久耐受。相反，AIE暴露导致了持久的血浆ALT水平升高，提示青春期乙醇暴露造成了未能随戒断而消退的持续性肝脏损伤。其次，在脑内HMGB1表达方面，研究揭示了显著的区域特异性。在海马结构，AIE导致了HMGB1+IR的差异性改变：持久增加了齿状回的HMGB1+IR，但降低了CA3和CA1区的HMGB1+IR。重要的是，在无乙醇暴露史的对照组中，急性乙醇挑战显著降低了齿状回、CA3和CA1区的HMGB1+IR；然而，在有AIE史的大鼠中，急性乙醇挑战未能改变任何海马亚区的HMGB1+IR，这强有力地表明AIE导致了对乙醇诱导的海马HMGB1细胞外排产生持久耐受。在杏仁核，仅在BLA中，急性乙醇挑战选择性地增加了AIE组大鼠的HMGB1+IR，而CeA无变化。为确认海马HMGB1+IR的降低是源于蛋白释放而非转录下调，研究人员在海马过表达了带FLAG标签的HMGB1蛋白。结果发现，即使在HMGB1被病毒载体强制过表达的情况下，急性乙醇挑战仍显著降低了齿状回中HMGB1-FLAG的表达面积和强度，证实急性乙醇确实诱导了HMGB1的细胞外释放。第三，在脑内COX-2表达方面，AIE在基础条件下持久增加了齿状回、CA3和BLA的COX-2+IR。在对乙醇的反应性上，急性乙醇挑战在对照组大鼠中选择性地降低了CA1区的COX-2+IR并增加了BLA的COX-2+IR；然而，在有AIE史的大鼠中，这些区域的COX-2表达均未对急性乙醇挑战产生反应，表明AIE也导致了对乙醇诱导的COX-2反应性改变。第四，在神经元可塑性标志物Arc表达方面，AIE导致了区域特异性改变。在基础条件下，AIE显著降低了CeA和BLA的Arc+IR。对于急性乙醇挑战的反应，在无乙醇暴露史的对照组中，乙醇降低了齿状回和BLA的Arc+IR，却强烈增加了CeA的Arc+IR；而在有AIE史的大鼠中，齿状回和BLA的Arc表达对急性乙醇挑战不再敏感，显示出反应耐受。最后，相关性分析表明，在海马整体水平上，HMGB1表达与COX-2表达呈显著正相关，但两者均与Arc表达无显著相关性，提示先天免疫信号通路的变化与神经元即刻早期基因的表达变化是相互独立的。讨论部分总结指出，青春期乙醇暴露能够持久地、区域特异性地重编程大脑对后期急性乙醇挑战的免疫和神经元反应性。具体表现为，AIE诱导了海马和外周对乙醇诱导的HMGB1反应产生耐受，并上调了多个脑区的基础COX-2和HMGB1表达，同时改变了关键脑区的Arc表达模式。这些免疫与神经可塑性标志物的反应模式在脑区之间和分子之间存在显著差异，表明AIE并非全局性地重编程大脑先天免疫系统，而是以刺激和脑区特异的模式系统地扰乱了特定的信号通路。研究结论部分（Conclusions）指出：AIE驱动的先天免疫反应性改变具有脑区、分子信号和刺激的特异性。尽管AIE暴露后成年期急性乙醇挑战对HMGB1信号的持久影响模式与其他先天免疫标志物的反应模式不同，突出了先天免疫信号网络的复杂性。这表明青春期乙醇暴露不一定全局性地重编大脑先天免疫系统，而是以刺激和脑区特异的模式系统性地扰乱了如HMGB1这样的特定信号通路。值得注意的是，本研究采用了胃内乙醇给药以复现人类暴饮的快速高血醇浓度特征，未来的研究需要确定自愿饮酒的慢性暴露范式是否会产生类似的持久重编程效应。此外，尽管AIE降低了成年期的血醇浓度，但两组动物的乙醇浓度依然很高，且不同分子终点的重编程效应各异，表明药代动力学特征的改变可能无法完全解释反应性的适应。总之，这些发现扩展了以往将HMGB1信号与AIE诱发的乙醇行为耐受及AUD病理联系起来的研究，首次提供了AIE能产生脑区特异性的HMGB1调控，并诱导对急性乙醇诱发的海马HMGB1表达降低产生耐受的证据。