基于亲水作用色谱（HILIC）与LC-MS/MS联用技术的人类血浆维生素B1、B2、B6和B12同步测定方法的开发与验证

《Results in Chemistry》：Development and validation of LC-MS/MS method for the simultaneous determination of vitamin B1, B2, B6 and B12 using human plasma (commercially pooled) with hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)

　　

研究人员开发并验证了一种简单、可靠且灵敏的分析方法，用于使用亲水作用色谱（HILIC）技术，通过高效液相色谱（HPLC）与质谱联用（LC-MS/MS），从商业混合人血浆中同步测定维生素B1（盐酸硫胺素）、B2（（-）-核黄素）、B6（盐酸吡哆醇）和B12（氰钴胺）。分析使用由乙酸铵水溶液缓冲液和乙腈组成的流动相进行，在HILIC色谱柱（L3，美国药典色谱柱列表）上以梯度模式操作。检测采用电喷雾电离（ESI）在正离子模式下进行。样本提取采用蛋白沉淀技术。色谱方法依据国际协调理事会（ICH）指导原则Q2(R1)对检测限（LOD）、线性、稳健性、系统适用性试验进行验证，并依据ICH指导原则M10对选择性、定量下限（LLOQ）、准确度、精密度和基质效应进行验证。维生素B1、B2、B6和B12的LLOQ浓度分别为0.05、0.8、0.2、5.0 ng/mL，LOD分别为0.01、0.4、0.08、3 ng/mL。所有维生素在LOD水平均显示出可靠的检测。LLOQ水平涵盖了维生素B1、B2、B6的临床范围，但对B12的覆盖有限。所有维生素的决定系数（r²）均≥0.99，表明在维生素B6、B2、B1和B12的定量范围（分别为0.2–50.0 ng/mL、0.8–50.0 ng/mL、0.05–5.0 ng/mL、5.0–300.0 ng/mL）内具有良好的线性。准确度和精密度、萃取回收率和基质效应的结果均可接受，在所有测试水平上均在85–115%范围内，且变异系数（CV%）≤15%（n?=?3）。稳健性和系统适用性试验参数符合r²?≥?0.99的验收标准，证实该方法在本研究中适用。

水溶性维生素在人体代谢和生理功能中扮演着关键角色，其在血浆中的浓度是评估营养状况和诊断相关疾病的重要指标。临床上，接受减重手术的患者由于胃肠道解剖结构和功能改变，常出现维生素B1、B2、B6和B12的吸收障碍和缺乏风险，这与严重的神经、免疫及代谢并发症相关。因此，准确灵敏地定量血浆中这些维生素对临床监测和治疗决策至关重要。目前，测定水溶性维生素的分析方法多依赖于反相色谱（RP），但其常需使用离子对试剂以改善极性分析物的保留和峰形，这会导致平衡时间延长和运行时间增加。相比之下，亲水作用色谱（HILIC）因其能有效保留极性化合物，提供更尖锐的峰形、增强的质谱（MS）灵敏度和更好的重现性，被认为是更优的技术选择，然而其在生物基质（如血浆）中维生素分析的应用仍未得到充分探索。在此背景下，研究人员旨在开发并验证一种基于HILIC与LC-MS/MS联用的简单、可靠且灵敏的方法，以实现商业混合人血浆中维生素B1、B2、B6和B12的同步定量，该研究成果发表于《Results in Chemistry》。为实现这一目标，研究人员采用了几个主要的关键技术方法。首先，使用Zic-pHILIC色谱柱进行色谱分离，以乙酸铵缓冲液和乙腈为流动相进行梯度洗脱。其次，采用电喷雾电离源（ESI）在正离子模式下，通过三重四极杆质谱仪进行多反应监测（MRM）检测，维生素B3（烟酰胺）作为内标。样本前处理采用优化的蛋白沉淀法，依次使用酸化甲醇-水-乙腈混合物沉淀蛋白，再用硫酸锌和饱和硫酸铵进一步处理，最终复溶后进样。方法验证严格依据ICH指导原则Q2(R1)和M10进行，评估了选择性、线性、准确度、精密度、稳定性、基质效应、萃取回收率、稳健性和系统适用性等参数，所有验证均在商业混合人血浆基质中进行。研究结果部分详细展示了方法开发与验证的过程。在方法开发方面，研究人员确定了以100 mM乙酸铵（含0.5%冰醋酸）与乙腈为流动相的梯度条件，并在HILIC色谱柱上实现了维生素B3（内标）、B6、B2、B1和B12的良好分离，总运行时间为20分钟。通过优化蛋白沉淀程序，获得了干净的提取物，控制血浆色谱图证实了方法对内源性维生素的检测能力。在方法验证结果方面，选择性通过优化每个化合物的特征质谱碎片（前体离子和产物离子）及保留时间得以确认，LLOQ标准、空白血浆和LLOQ加标血浆的色谱图对比证实了方法的专属性。线性评估显示，在各自范围内（维生素B6: 0.2–50.0 ng/mL；B2: 0.8–50.0 ng/mL；B1: 0.05–5.0 ng/mL；B12: 5.0–300.0 ng/mL），所有维生素的校准曲线决定系数（r²）均≥0.99，线性关系良好。定量下限（LLOQ）和检测限（LOD）均成功建立，其准确度（%回收率）和精密度（%RSD）均符合验收标准（LLOQ准确度在标称值±20%内，其他水平在±15%内；%RSD ≤20% 或 ≤15%）。日内和日间准确度与精密度评估结果均在可接受范围内。处理后样品的稳定性测试表明，在自动进样器中4°C储存12小时内，所有分析物稳定（%测定值在标称浓度±15%内）。残留效应测试未观察到明显的交叉污染。萃取回收率、基质效应和过程效率评估结果显示，萃取回收率在90.0%至120.0%之间，基质效应在85%至115%范围内，表明方法受基质干扰小且提取效率高。稳健性研究通过微小调整色谱（流速、柱温）和质谱（接口温度、脱溶剂气温度）参数进行，所有变动下校准曲线的r²仍≥0.99，证实方法耐用。系统适用性试验也满足r²?≥?0.99的标准。最后，研究人员将本方法与已发表的其他基于LC-MS/MS的反相或HILIC方法进行了比较。结果显示，本方法对于维生素B1、B2和B6的萃取回收率、基质效应等性能指标与文献报道相当或更优，且无显著基质抑制，支持其用于临床血浆样本的可靠定量。然而，本方法的维生素B12定量下限（5.0 ng/mL）未能完全覆盖其在人血浆中的临床相关浓度范围，这一限制可能与血浆基质的复杂性、维生素B12的高分子量和强极性导致的电喷雾电离效率不足有关。讨论部分总结指出，开发的基于HILIC的LC-MS/MS方法简单、可靠、准确，具有合理的运行时间、尖锐的峰形、无需衍生化或离子对试剂的简便样本前处理优势。该方法已通过全面的分析验证，被证明具有选择性、灵敏性、精密度、准确度、稳健性和线性。它为定量人血浆中的维生素B1、B2和B6提供了最简单且灵敏的分析技术，覆盖了其整个临床范围，但对于维生素B12的浓度检测有限。研究结论部分指出，本研究提出了一种使用LC-MS/MS从商业混合人血浆中定量水溶性维生素B1、B2、B6和B12的方法，分析物经提取后在HILIC色谱柱上进行分析。开发的HILIC方法简单、可靠、准确，运行时间合理，峰形尖锐，样本制备简便且无需使用衍生化试剂，流动相中也不包含其他反相色谱方法中常用的、会导致保留时间延长的离子对试剂。方法依据ICH指导原则Q2(R1)和M10进行了验证，所有验证参数均符合验收标准，因此被认为具有选择性、灵敏性、精密度、准确度、稳健性，并在范围内具有线性。该方法为使用LC-MS/MS定量商业人血浆中的水溶性维生素B1、B2和B6提供了最简单且灵敏的分析技术，因为其覆盖了这些维生素的整个临床范围，但对于人血浆中的维生素B12浓度检测则存在局限性。研究人员的发现有望激发临床实验室进一步的调查研究，特别是聚焦于使用本文提出或第3.3节中讨论的分析或仪器策略，评估临床样本并优化血浆中维生素B12的临床浓度。此外，该验证方法也可用于评估个性化营养，考虑临床实验室对样本的适当临床需求，这也能推动该领域的发展。为了实现高分析通量，该方法可转换为使用等效HILIC色谱柱的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法，用于血浆中这些水溶性维生素的定量。