聚焦核苷酸：固态NMR技术探究ATP酶SmsC中的ATP水解

《Chemistry – A European Journal》：Spotlight on the Nucleotide: Solid-State NMR for the Investigation of ATP Hydrolysis in the ATPase SmsC

　　

固态核磁共振（NMR）波谱学是在原子分辨率下研究ATP驱动过程中ATP水解反应的理想工具。在本研究中，研究人员提出了一种基于核苷酸检测的固态NMR方法，以二聚体P环ATP酶SmsC为模型蛋白，探究ATP水解过程中核苷酸的构象和动态变化。在魔角旋转（MAS）条件下进行的³¹P检测固态NMR实验，揭示了ATP水解的不同阶段，这些阶段通过通常被认为“不可水解”的ATP类似物进行了模拟。研究数据显示，此类ATP类似物表现出不同程度的构象异质性。通过计算建模，研究人员探讨了SmsC与核苷酸末端磷酸基团之间的氢键在定义核苷酸结合构象中的作用。对结合的ATP类似物进行了同核³¹P-³¹P偶极耦合常数测量，以获取其动态特性信息。这些数据表明，ATP及其过渡态类似物保持一定的分子运动，而水解后类似物AMPCP的动态性显著降低。本文提出的用于研究ATP水解的方法可以轻松地转移到其他ATP供能蛋白，包括难以表达的蛋白质或大型蛋白质复合物，从而为这些体系的功能表征提供了一条途径。

固态核磁共振（NMR）波谱学是研究ATP水解反应的强大方法，因为它能够以原子分辨率获取蛋白质结合核苷酸的结构和动态信息[1]。NMR能够精确鉴定结合位点，甚至适用于检测参与结合的非共价相互作用，例如氢键[2-4]。获得高分辨率的结构和动态信息的能力，使其在结构生物学领域（如X射线衍射（XRD）或冷冻电子显微镜（EM））相比其他技术具有显著优势，目前这些技术难以获得例如定位参与氢键的确切氢原子位置所需的亚埃级分辨率[5]。固态NMR在研究ATP水解方面的威力已在多种蛋白质中得到报道，包括细菌解旋酶DnaB[2, 6, 7]、质粒pRN1的古菌引发酶[8]、ATP结合盒（ABC）转运蛋白BmrA[9]或ATP酶p97[10-12]，从而能够研究ATP水解与生物功能的耦合。
ATP水解过程可分为四个不同阶段（方案1）：（i）蛋白质的apo状态，即无核苷酸结合；（ii）水解前的ATP结合状态；（iii）过渡态，其中P_β-O-P_γ键断裂；以及（iv）水解后状态，此时水解产物腺苷二磷酸（ADP）与ATP酶结合。在大多数情况下，阶段（ii）和（iii）仅短暂存在。为了使用X射线晶体学、冷冻电镜或NMR进行结构研究，需要使用缓慢或不可水解的核苷酸类似物来捕获尽可能接近生理相关状态的稳定快照，以模拟水解反应[13]。阶段（ii）中的ATP可以使用例如腺苷5’(β,γ-亚氨基)三磷酸（AMPPNP）或腺苷5’(β,γ-亚甲基)三磷酸（AMPPCP）（方案S1）来模拟，其中P_β和P_γ磷酸之间的氧原子分别被胺基或亚甲基取代[14-16]。ATP水解的过渡态（阶段（iii））可以使用例如AlF₄^-来模拟，它模拟了直链阴离子过渡态[17, 18]。已有报道使用固态NMR和电子顺磁共振（EPR）对DnaB的该阶段进行了详细的光谱研究[2]。在大多数情况下，阶段（iv）可以轻松评估，因为此时ADP与蛋白质结合，通常不会被进一步水解[7]。
在本研究中，研究人员旨在利用基于核苷酸检测的固态NMR波谱学，阐明ATP水解循环中核苷酸的构象和动态。核苷酸检测的NMR方法的优势在于，不需要对蛋白质进行特定的同位素标记，也无需进行耗时的蛋白质共振归属，即可专注于酶促反应，如ATP水解。相反，³¹P是一个相当灵敏的NMR自旋-1/2核，其旋磁比仅比¹H小约2.5倍，且天然丰度为100%。此外，其大的化学位移色散使其适用于探测核苷酸构象及其在蛋白质结合后的变化[13, 20]。典型的大的化学位移各向异性（CSA）的变化提供了有关核苷酸动态性质的信息。因此，它作为基于核苷酸检测的固态NMR研究的高度灵敏探针，可应用于核苷酸浓度低的情况，例如在大型蛋白质复合物中甚至在细胞内。另一个优势在于可以使用合适的ATP类似物实时跟踪ATP水解反应。研究人员使用产甲烷古菌Methanocaldococcus jannaschii的ATP酶SmsC（本研究首次通过固态NMR进行研究）来阐释这一方法，揭示了ATP水解过程中核苷酸构象的前所未有的见解，并突显了固态NMR在研究小配体与大型生物大分子结合方面的更广泛效用。
研究人员的模型蛋白SmsC属于ABC型P环ATP酶[21]。除了ABC签名基序（ABC-signature motif）外，它还包含Walker A和Walker B基序，这些基序已知在ATP水解中起关键作用[19, 22]。然而，P环ATP酶中的ATP水解确切机制可能各不相同，对于SmsC仍需研究[23, 24]。负责铁硫（Fe-S）簇生物发生的系统之一是Suf系统[25]，Fe-S簇在生命过程中至关重要，例如在呼吸链中。该复合物存在不同的变体，总是包含SufB和SufC蛋白，例如在大肠杆菌中编码为SufABCDSE操纵子，而在枯草芽孢杆菌中编码为SufCDSUB[26]。最简单的版本仅由SufB和SufC蛋白组成，可在产甲烷古菌中发现[27]。因此，它被归类为最小Suf系统（Sms），并被认为是Suf系统的古老同源物，甚至可能追溯到最后的共同祖先（LUCA）[27]。最近发现，在Sms系统中，SmsC蛋白承载Fe-S簇的结合位点，并具有ATP酶活性。Fe-S簇形成和ATP结合是相互排斥的。这与Suf系统显著不同，在Suf系统中，SufB承载Fe-S结合位点[19]。Suf或Sms系统特别值得关注，因为它在人类中不存在，但在各种病原体（如寄生虫Blastocytis[28]、疟原虫Plasmodium falciparum[29]、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus[30]和结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis[31]）的Fe-S簇生物发生中起核心作用。这使其成为开发新型病原体特异性药物或抗生素的有前景的靶点。已经开发出针对S. aureus的小分子靶向药物，该药物抑制Suf系统[32]。
2.1 ³¹P谱指纹揭示构象异质性信息
研究人员最初旨在通过生产均匀¹³C和¹⁵N同位素标记的蛋白质样品来证明SmsC的成功细菌生产策略。尽管SmsC的相对分子量较低，约为28 kDa（250个氨基酸残基），但使用210,000 g的离心力，蛋白质可以在过夜后沉降进魔角旋转（MAS）NMR转子中，这可能得益于高蛋白质浓度下之前观察到的二聚体（或更高寡聚体）的形成[33-35]。ATP结合后二聚化是SufC蛋白与SufB和SufD复合物的已知行为[22]。获得的¹³C检测的二维NMR谱（¹³C-¹³C二维偶极辅助旋转共振（DARR）[36]和¹⁵N-¹³C NCA谱，图S1）分辨率良好，表明蛋白质构象折叠良好[37]。从在100 kHz MAS频率下记录的质子检测NMR谱中也可以得出相同结论（关于此类谱图的讨论见支持信息）。发现SmsC具有相对较短的旋转坐标系纵向弛豫时间（T_1ρ），这使得由于交叉极化（CP）极化转移步骤效率相当低，难以采集具有足够信噪比（SNR）的三维实验（图S2）。接下来，研究人员提出了一种核苷酸检测方法，仅使用天然丰度的蛋白质样品来研究SmsC的核苷酸结合状态。SmsC-核苷酸样品是通过将蛋白质样品与过量的MgCl₂和核苷酸类似物孵育后，简单地过夜沉降制备的。
通过使用ATP类似物AMPPNP[16]和AMPPCP[14]（化学结构见方案S1），成功捕获了SmsC ATP水解的初始状态（水解前状态），其中三磷酸盐与蛋白质结合，但尚未发生水解。SmsC:AMPPNP复合物的首个¹H-³¹P CP-MAS NMR谱是在样品制备四天后采集的（图1A）。这种基于偶极耦合的CP谱仅显示足够固定化（蛋白质结合）的核苷酸，其CP极化转移相当高效[13, 38]。在此情况下，观察到三个相当尖锐的³¹P共振，分别归属于三磷酸盐的三个不同磷酸基团（图1A）。这三个共振的归属是基于二维³¹P-³¹P DARR谱（图1B）以及之前报道的AMPPNP在不同蛋白质体系中的³¹P化学位移值（P_α、P_β和P_γ分别在-11.7 ppm、-4.2 ppm和-1.9 ppm处共振）[6, 13, 39, 40]实现的。这些数据表明AMPPNP在SmsC中存在单一、定义明确的结合位点。由于SmsC在体内与SmsB形成复合物存在，研究人员探究了AMPPNP与SmsC的结合是否不同于与SmsCB复合物的结合。为此，制备了SmsCB:AMPPNP样品。该样品中的AMPPNP共振与SmsC:AMPPNP中的AMPPNP共振完美重叠（图S3），表明AMPPNP的结合模式在孤立的SmsC与蛋白质复合物SmsCB中高度相似。SmsCB中的结合AMPPNP共振甚至更窄，指向构象无序度更低。
相比之下，SmsC:AMPPCP复合物不仅显示出预期的三个不同的³¹P共振，而且观察到至少两个归属于P_α磷酸基的重叠共振，以及至少五个可归属于P_β和P_γ磷酸基团的共振（图1A）。无法将这些共振明确归属于特定的磷酸基团，因为³¹P化学位移的确切值受到配位蛋白质残基的显著影响[13]。AMPPCP共振的不同集合可能是由于AMPPCP与SmsC的不同结合构象所致。
有趣的是，与之前报道不同（例如细菌DnaB解旋酶，报道了各种结合ATP类似物的长期稳定（数年）的沉降蛋白样品[35]），两种SmsC:核苷酸复合物在数周的时间尺度上并不稳定。在SmsC:AMPPNP样品中，制备后52天（期间MAS转子在4°C下储存），出现了额外的³¹P共振（图S4，注意未进行详细的时间分辨稳定性测试）。这些共振可归属于水解产物AMPPN（在-10.5 ppm和-3.1 ppm处）、游离磷酸盐（P_i）（在1.6 ppm处）和腺苷一磷酸（AMP）（在2.9 ppm处）。对于复合物SmsCB也发现了类似情况（图S3B）。形成的AMPPN可能来自上清液中过量核苷酸的自动水解或酶促水解。尽管在多种情况下报道了AMPPCP比AMPPNP具有更高的稳定性[13, 41]，但在75天后，也观察到一些微小的谱图变化，例如归属于沉淀的双膦酸盐物种（PCP）的共振出现[42]（图S4）。总之，AMPPNP采用的结合构象比AMPPCP更明确，后者明显表现出多种结合构象。这种明确的结合构象使得AMPPNP成为进一步研究水解前状态更合适的ATP类似物，尽管其随时间不稳定。
接下来，研究人员尝试通过使用ADP:AlF₄^-作为ATP类似物来捕获与ATP水解过渡态非常接近的酶状态[13, 17, 18]。该样品的¹H-³¹P CP-MAS NMR谱在-6.0 ppm和-8.9 ppm处具有两个³¹P共振，归属于采用单一结合构象的ADP:AlF₄^-，以及另一个在0.6 ppm处的共振，表明存在P_i（图1A）。归属进一步通过二维³¹P-³¹P DARR谱（图S5）证实。在细菌DnaB解旋酶与ADP:AlF₄^-的复合物中报道了类似的³¹P化学位移值（P_α在-6.1 ppm，P_β在-7.4 ppm）[7]。ADP:AlF₄^-的共振也与SmsC:ADP复合物的共振显著不同（见下文，表S1），这进一步支持了SmsC:ADP:AlF₄^-复合物的成功形成（另见图S6的¹⁹F MAS NMR谱）。谱图中观察到的P_i物种可能是在制备ADP:AlF₄^-期间由酶促水解或水解形成。除了归属于SmsC:ADP:AlF₄^-复合物的两个尖锐³¹P共振（图1A）外，还检测到两个较宽的共振。这些可能来自在样品制备过程中与Al(OH)₃共沉淀的ADP[43]。
为了捕获处于水解后状态的酶，研究人员最初将SmsC与ADP孵育。SmsC:ADP复合物的形成通过¹H-³¹P CP-MAS NMR谱中在-2.8 ppm和-10.4 ppm处的两个³¹P共振得到证实（图1A）。通过比较SmsC:ADP与SmsCB:ADP的ADP共振，验证了ADP在SmsC和SmsCB复合物中的高度相似的结合构象（图S7）。重叠的共振表明两个复合物的结合构象相似。此外，观察到³¹P共振的线宽存在显著差异（SmsCB:ADP线宽更小），指向SmsCB中ADP结合的构象灵活性低于SmsC。之前报道了ATP及其类似物对SmsBC和同源物Suf具有更高的结合亲和力[19, 44]。与AMPPNP的观察结果类似，SmsC:ADP复合物在数天的时间尺度上不稳定（期间沉降的蛋白质样品在4°C下储存）（图S8）。接下来，研究人员使用腺苷(α,β-亚甲基)二磷酸（AMPCP）[45]（方案S1）作为水解后状态的类似物，其中ADP中存在的P-O-P基序被P-CH₂-P基序取代。SmsC:AMPCP显示出三个不同的SmsC结合AMPCP构象，其³¹P化学位移值为27.6 ppm、25.4 ppm和22.8 ppm（P_α），以及在12.8 ppm和11.9 ppm（P_β）处的两个可分辨的共振（图1A）。³¹P共振归属基于游离核苷酸的溶液态NMR谱[46]。这五个不同的峰在二维³¹P-³¹P DARR谱中显示出三个不同的交叉峰，支持AMPCP至少存在三种不同的结合构象（图1C）。P-O-P键的缺失也阻止了SmsC对核苷酸的水解，如在转子填充数周后记录的³¹P谱（期间沉降的蛋白质样品储存在4°C）所示（图S8）。谱图的分辨率和SNR甚至随时间增加，其原因仍需进一步研究。因此，AMPCP在结合到SmsC时充当长期稳定的ADP类似物，尽管观察到显著的构象异质性。接下来，研究人员试图建立各种SmsC:核苷酸复合物的模型，以获取光谱观察到的核苷酸结合行为差异的线索。
2.2 核苷酸结合域的结构建模指出氢键在定义核苷酸结合中的重要性
基于最近发表的SmsC与AMPPN的单晶结构（PDB登录码9H7X）[19]，使用MOE软件中的局部对接（见实验部分）对具有不同结合核苷酸的SmsC结构进行了建模。建模未包含光谱数据。从共结晶的AMPPN分子开始，其他核苷酸在结合口袋中构建，随后进行局部诱导契合对接，同时蛋白质其余部分保持固定（图2）。建模工作旨在识别从¹H-³¹P CP-MAS NMR谱得出的AMPCP和AMPPCP不同结合构象的可能原因。为此，将SmsC:AMPPNP的模型与SmsC:AMPPCP的模型进行比较，将SmsC:ADP的模型与SmsC:AMPCP的模型进行比较。对于复合物SmsC:AMPPNP和SmsC:ADP，在CP谱中观察到单组³¹P共振，表明核苷酸结合构象高度确定。对于SmsC:AMPPNP的模型，基于观察到的空间接近性，假设Gly42的骨架酰胺质子与连接P_β和P_γ的氮原子之间存在氢键（图2A）。该残基位于Walker A基序中的K–3位置，通常与连接P_β和P_γ的氧原子以及γ-磷酸上的氧形成氢键[24]。由于CH₂基团无法作为氢键受体，这种氢键的形成对于AMPPCP是不可能的（图2B）。这种缺失的氢键可能解释了实验观察到的AMPPCP结合到SmsC时的构象无序，因为其形成可能对这种分子识别事件至关重要。
对于建模的SmsC:ADP结构，确定了Ser147与连接P_α和P_β的氧之间可能的氢键（图2C）。Ser147是LSGGQ ABC签名基序中的保守残基。由于Ser147的OH与ADP的氧之间的距离为3.5 ?，对于典型的氢键来说稍长，可能由水分子桥接。已知ABC签名基序以与SmsC中观察到的头对尾方式参与ABC转运蛋白中的ATP结合[47]。同样，AMPCP中的CH₂单元无法作为氢键受体（图2D）。SmsC:AMPCP结构中由此产生的缺失氢键可能同样解释了AMPCP的构象无序，类似于AMPPCP的情况。
³¹P-³¹P同核偶极耦合测量揭示了与SmsC结合的ADP:AlF₄^-和AMPCP的不同分子动态
接下来，研究人员通过量化同核³¹P-³¹P偶极耦合强度来探测结合核苷酸的分子动态。为此，进行了³¹P-³¹P恒定时间偶极重耦合效应核自旋对齐减少（CT-DRENAR）实验（据研究人员所知，首次应用于蛋白质核苷酸复合物），其中在MAS条件下使用背对背（BaBa）双量子（DQ）激发方案重耦合³¹P同核偶极耦合[48-50]。两个核之间的同核偶极耦合常数在孤立的两自旋体系中直接与两个核之间的距离通过方程（1）相关，其中b_jk表示核j和k之间的偶极耦合常数（单位为rad?s^-1），μ₀为真空磁导率，γ为旋磁比，r_jk为核j和k之间的距离。
(1)
偶极耦合常数通过将实验CT-DRENAR曲线拟合到一阶近似（方程（2））来确定：[48]
(2) 其中 S₀表示参考信号，S’表示偶极去相位信号，φ表示相位偏移，t_d表示偶极演化时间（表S2）。二磷酸盐或三磷酸盐中两个磷酸基团之间的预期距离约为3 ?，如在多个P-X-P晶体结构以及ATP晶体结构中所发现的[14, 16, 51]，这对应于约–730 Hz的³¹P-³¹P偶极耦合常数。然而，有多种因素影响通过CT-DRENAR实验测得的有效偶极耦合常数，例如³¹P CSA导致(S₀–S’)/S₀值降低，从而低估偶极耦合。这些因素可以按照支持信息中描述的程序（另见参考文献[48, 52]以获取更多细节）进行经验校正。因此，在此情况下确定的偶极耦合常数不应转换为精确的距离（因为某些情况下CSA相当显著，见下文），但对不同ATP类似物进行定性比较可提供有关蛋白质结合核苷酸动态特性的重要见解[53]。由于分子运动会显著降低偶极耦合相互作用以及CSA，因此这两个量的组合有助于研究结合核苷酸的动态。研究人员注意到，在快速MAS频率下进行CT-DRENAR实验可以显著降低CSA对获得的偶极耦合常数的影响。这种实验设置目前正在研究人员的实验室中进一步研究。
比较SmsC:AMPCP和SmsC:ADP:AlF₄^-的CT-DRENAR曲线，在θ = 0°时，AMPCP的表观偶极耦合明显高于ADP:AlF₄^-（图3A、B）。类似地，从慢自旋MAS谱确定的AMPCP的³¹P CSA显著高于ADP:AlF₄^-（图S9和S10；表S3和S4）。SmsC:ADP:AlF₄^-的小CSA（还原各向异性δσ为0.05 kHz）相当出乎意料，因为例如在幽门螺杆菌细菌解旋酶DnaB结合相同核苷酸时确定了显著更高的³¹P CSA[2, 7]（图S11和表S5）。大的CSA会导致偶极耦合常数被低估，因此校正后的AMPCP偶极耦合常数甚至大于ADP:AlF₄^-与实验曲线观察到的差异相比（表S2）。CT-DRENAR曲线以及CSA都表明与AMPCP相比，蛋白质结合的ADP:AlF₄^-存在一些分子运动。观察到的分子动态差异可能是由于SmsC在ATP水解过程中发生构象变化。已知SmsC和SufC在ATP水解循环中从开放构象转变为闭合构象[19, 22]。这种行为也可能解释观察到的核苷酸动态变化。研究人员将过渡态（由ADP:AlF₄^-模拟）中较高的分子动态归因于SmsC处于开放构象，而将水解后状态（由AMPCP模拟）中降低的分子动态归因于SmsC的闭合构象。水解前的SmsC:AMPPNP复合物的行为类似于ADP:AlF₄^-复合物（例如，测得的³¹P-³¹P偶极耦合常数降低），因此研究人员推测AMPPNP在结合到SmsC时也保持一定程度的动态（图S12），并且蛋白质可能采用开放构象，研究人员将在未来工作中进一步探索。
2.3 沉降样品中AMPPNP水解反应的实时NMR追踪
最后，研究人员想知道缓慢水解的ATP类似物是否提供了独特的机会，通过NMR实时跟踪核苷酸的水解。之前已经进行了ATP酶的实时固态NMR实验，例如ABC转运蛋白LmrA[54]和MsbA[55]、ATP酶p97[10]、二酰基甘油激酶[56]以及古菌pRN1引发酶[42]。因此，研究人员决定探索水解前的ATP类似物AMPPNP。与之前展示的谱图（图1）不同，对SmsC的实时NMR谱在30°C的样品温度下采集，以加速核苷酸水解并能够在数天的NMR测量时间尺度上进行光谱观察（图4）。由于SmsC源自嗜热古菌M. jannaschii，蛋白质在环境温度下不会变性。对沉降的蛋白质样品收集了时间分辨的¹H-³¹P CP-MAS NMR谱（图4A）。
令人惊讶的是，观察到的反应产物是AMP（在1.6 ppm处）和亚氨基二磷酸（PNP）（在-7.5 ppm处）（图4A）。AMP共振显著展宽，指向在蛋白质表面的非特异性吸附。尖锐的PNP信号暗示其与反应混合物中存在的Mg²⁺形成复合物沉淀。为了进一步证实这个单一共振确实属于PNP中两个对称的磷酸基团，通过记录CT-DRENAR[48]曲线确定了该³¹P共振的同核偶极耦合常数（图4B）。如果该共振确实是PNP，它应表现出约-720 Hz的³¹P偶极耦合常数，对应于之前报道的约3 ?的距离[14, 16]。测得的偶极耦合为-548 Hz，略小于预期值，将指向3.3 ?的P-P距离。偶极耦合被低估的原因很可能是³¹P CSA，在数据分析中未进一步考虑。这一发现与最近在古菌pRN1引发酶催化的二核苷酸形成反应中观察到的情况一致，期间形成了双膦酸盐（PCP），报道了其在MAS NMR转子中与Mg²⁺形成复合物沉淀[42]。因此，在MAS NMR转子中使用的实验条件下，蛋白质催化了AMPPNP水解为AMP和PNP（图4C），而在溶液中，无论是在NMR谱中还是在NMR管中形成可见沉淀，均未发现PNP形成的迹象。相反，观察到SmsC催化AMPPNP水解为AMPPN和P_i（图S13，关于AMPPNP自动水解的贡献见图S14）。沉降样品和溶液中水解行为差异的原因可能与不同的蛋白质浓度（分别为300和24 mg/mL）、MAS效应以及微小的温度差异有关。AMPPNP的P-O-P键水解对于ATP酶来说非常罕见，但之前已有报道，例如蛇毒磷酸二酯酶[16]。相反，AMPPNP中P-N-P键的水解相当普遍，之前已在多种蛋白质中观察到，例如蛋白质ncd的马达结构域[39]、肌浆网Ca²⁺-ATP酶[57]、解旋酶DnaB[6]或牛心线粒体ATP酶[58]。
3 结论
本研究采用了一种基于核苷酸检测的固态NMR方法，通过探索尽可能接近ATP水解反应不同阶段的ATP类似物（图5），来跟踪ATP酶SmsC催化的ATP水解。在水解前ATP类似物AMPPCP和水解后ATP类似物AMPCP的核苷酸结合中观察到构象异质性，而在AMPPNP、ADP:AlF₄^-和ADP中则发现了单一、明确的结合构象。然而，后者的SmsC:核苷酸复合物容易发生水解。借助结构建模，研究人员确定了通往末端磷酸基团的原子形成氢键在获得明确的核苷酸结合构象中的重要性。如果无法形成氢键，如AMPCP和AMPPCP的情况，则检测到核苷酸的多种结合构象。为了进一步将结合异质性与核苷酸移动性相关联，研究人员首次采用CT-DRENAR脉冲方案测量³¹P-³¹P同核偶极耦合，以探测核苷酸分子动态。ATP水解过程中结合核苷酸动态的差异可能与蛋白质在水解循环中的构象变化有关，例如从开放到闭合构象的转变。通过在沉降的SmsC蛋白质样品上进行实时NMR，获得了AMPPNP水解的动力学信息，揭示了AMPPNP在P_α和P_β之间的水解，这与溶液中发生在P_β和P_γ之间的断裂形成对比。本文提出的基于核苷酸检测的方法显然受益于不需要昂贵的¹³C/¹⁵N同位素标记策略以及耗时的序列共振归属过程来监测酶促反应，这对于需要在哺乳动物细胞中表达的蛋白质尤其有用，因为在那里面临的同位素标记仍然具有挑战性。大型蛋白质或其复合物也受益于这种方法，因为对于这些情况，序列共振归属变得越来越困难甚至完全不可能。在ATP类似物中巧妙地引入额外的NMR活性核（如²D或¹⁹F）将为基于核苷酸检测的固态NMR波谱学的进一步有前景的应用铺平道路。