一种非共价结合的荧光探针，其荧光变化幅度较大，适用于Kv7通道的成像研究

《Analytica Chimica Acta》：A non-covalently bound fluorescent probe with a larger fluorescence change for imaging Kv7 channels

　　

高新欣|姜勤曦|赵一凡|栾坤|向伟|胡芳|张彦茹

青岛大学医学院药学院药物分析与药理学系，中国青岛市宁德路1号，266073

摘要

背景

Kv7通道（KCNQ通道）的功能障碍可能导致癫痫、耳聋、神经发育障碍和智力迟钝。监测Kv7通道的表达和功能对于理解其在生理和病理过程中的作用至关重要。虽然已经有一些小分子荧光探针被报道用于标记Kv7通道，但这些探针在受限旋转状态与自由旋转状态下的荧光变化仅约为3到8倍，因此容易受到背景荧光的干扰。因此，目前缺乏高灵敏度的探针来检测Kv7通道。

结果

这种新型荧光探针由于具有简单性、灵敏度和可视化等优点，成为了一种有效的工具。荧光光谱和紫外-可见光吸收光谱结果显示，FPKv-3探针表现出优异的光学特性。在甘油等粘性介质中，FPKv-3的荧光强度比在自由分散状态时增加了183倍。FPKv-3与Kv7.2/7.3通道结合时的荧光偏振（FP）值随浓度变化而变化，其解离常数（Kd）为0.66 μM。相比之下，FPKv-3与非转染的HEK293细胞膜结合时的FP值变化较小。电生理学和共聚焦成像实验表明，FPKv-3对Kv7通道具有高度选择性，优于其他通道（如TRPA1、TRPV3和TRPV1），为研究Kv7通道的作用提供了有效的化学工具。

意义与创新性

我们通过将香豆素荧光团与Kv7配体通过“长柔性链”连接，设计出了一种新型小分子荧光探针（FPKv-3）。FPKv-3在甘油溶液中的荧光强度比在PBS溶液中的增强了183倍，这有助于克服背景荧光的干扰。FPKv-3探针能够选择性地成像活细胞中的Kv7通道，并具有应用于Kv7激动剂高通量筛选的潜力。

引言

电压门控钾通道（Kv7）家族包含五种亚型（Kv7.1-Kv7.5）。[1]每种亚型分布在不同的组织中，并发挥独特的生理作用。[2]Kv7.1通道位于心脏和上皮组织中，其在心肌细胞中产生的慢电流IKs对心脏复极化至关重要。[3]Kv7.2和Kv7.3通道主要存在于神经系统，其突变可能导致M电流失调，从而引发癫痫和新生儿惊厥等疾病。[4],[5]Kv7.4通道主要表达在内耳毛细胞和听觉神经系统中，其功能障碍与常染色体显性非综合征性听力损失2型（DFNA2）有关。[6]Kv7.5通道不仅存在于神经系统，还存在于骨骼肌和平滑肌中，其异常功能与自闭症谱系障碍有关。[7]鉴于Kv7通道在神经系统中的多种生理和病理功能，检测其表达对于神经和精神疾病的诊断和治疗具有重要意义。

小分子荧光探针因其高灵敏度、低成本、易用性和可视化等优点而受到广泛关注，常用于标记生物大分子。近年来，一些基于AIE和TICT的荧光探针被用于标记蛋白质、核酸和其他生物大分子，但大多数探针在与目标生物大分子反应前后荧光强度的变化小于100倍（ΔF/F）。[8]因此，它们容易受到背景荧光的干扰。理想的探针在未结合状态下应具有弱荧光或无荧光，在结合状态下应发出强荧光。探针在结合状态下的荧光强度变化应超过100倍（ΔF/F）。[9]目前，已有两种探针FPKv-1和FPKv-2通过非共价结合方式用于检测和可视化Kv7.2/7.3通道。[10]然而，FPKv-1和FPKv-2在受限状态下的荧光强度仅比自由旋转状态增加了3到8倍。可用于可视化Kv7通道的荧光探针非常有限。

从FPKv-1和FPKv-2探针的结构可以看出，荧光团和配体仅通过一个键连接，导致荧光团与配体之间的距离非常短。我们推测这种短连接链可能导致荧光团和配体之间的相互干扰。配体可能影响荧光团的荧光发射，而荧光团也可能影响配体与目标蛋白的亲和力。因此，在本研究中，我们设计并合成了一种荧光探针FPKv-3（7-(二乙氨基)-N-(3-((4-((4-氟苯基)(丙-2-炔-1-基)-氨基)-2-甲基苯基)氨基)-3-氧丙基)-2-氧-2H-色烯-3-羧酰胺），利用分子内旋转效应来成像和监测Kv7通道。为了增强荧光变化和亲和力，我们使用“长链”来连接荧光团和配体。FPKv-3在分子旋转被抑制前后荧光强度变化显著，最大可达183倍。共聚焦显微镜和电生理学数据证实，FPKv-3能够特异性地标记和可视化Kv7通道。

章节片段

材料与设备

所有原材料均从BiddePharm、Macklin、Energy Chemicals和Sinopharm购买。电生理记录所需的试剂来自Sigma-Aldrich（上海，中国）。¹³C NMR（101 MHz）光谱在Bruker AVANCE Ⅲ HD 400 MHz光谱仪（德国）上获得，¹H NMR（600 MHz）光谱和¹³C NMR（151 MHz）光谱在JNM-ECZ600R/S1光谱仪上获得，溶剂使用d₆-DMSO，内标使用四甲基硅烷（TMS）。高分辨率质谱数据...

FPKv-3和FPKv-4探针的设计与合成

非共价结合荧光探针通常由三个部分组成：作为靶向基团的配体、作为报告基团的荧光团和连接链。靶向基团决定了探针的特异性，因此选择合适的配体对于荧光探针的设计至关重要。根据先前的研究，配体L3-8（方案1）对Kv7.2通道具有很强的亲和力，ΔV_1/2为-23.28 ± 1.37 mV，I/I₀为4.80 ± 0.73。[11]因此...

结论

带有“长柔性链”的FPKv-3探针在甘油溶液中的荧光强度比在PBS溶液中的强得多。FPKv-3在甘油溶液中的荧光强度比在PBS溶液中的增强了183倍，这有助于克服背景荧光的干扰。此外，FPKv-3探针能够选择性地成像活细胞中的Kv7通道，并具有应用于Kv7激动剂高通量筛选的潜力。

CRediT作者贡献声明

栾坤：监督、软件支持。赵一凡：资源提供、项目管理。姜勤曦：可视化处理、实验设计、数据管理。高新欣：初稿撰写、可视化处理、项目管理、实验设计、数据分析。张彦茹：审稿与编辑、监督、项目管理、方法学研究、资金筹集、概念构思。胡芳：项目管理、资金筹集。向伟：结果验证、实验设计

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了中国山东省自然科学基金（ZR2022MC049）对FH的研究资助。