改进了产柠檬酸的黑曲霉（Aspergillus niger ATCC 1015）的基因组组装技术

《Microbiology Resource Announcements》：Improved genome assembly of Aspergillus niger ATCC 1015, a citric acid-producing isolate

　　

摘要

我们提供了高质量的黑曲霉（Aspergillus niger）ATCC 1015的混合基因组组装结果，该菌株能够产生柠檬酸。该基因组由8条核染色体组成，总长度为35,617,925 bp（N50：4.3 Mb；GC含量：49.6%），以及一条31,333 bp的线粒体基因组，为生物技术研究和应用提供了宝贵的资源。

公告

黑曲霉ATCC 1015是一种用于生产柠檬酸的工业菌株（1）。在这里，我们展示了该菌株的新混合基因组组装结果，其连续性优于之前的版本（2、3）。这一资源增强了遗传基础，支持了生物技术应用的菌株工程研究。 黑曲霉ATCC 1015于2025年4月从Westerdijk真菌生物多样性研究所（CBS 113.46）获得，在测序前在最小培养基（1.5%琼脂、1%葡萄糖、1× ASPA + N、0.002 M MgSO?和1×微量元素溶液4）中传代两次。分生孢子被接种到含有0.5 g/L酪蛋白胨、2.5 g/L酵母提取物、1%葡萄糖、1× ASPA + N、0.002 M MgSO?和1×微量元素溶液的完整培养基中4，并在30°C下以150 rpm的速度振荡培养16小时。收获菌丝体后，使用40 mg/mL的VinoTaste（诺维信公司，丹麦Bagsv?rd）裂解酶在含有山梨醇、MES和CaCl?的缓冲液中制备原生质体4，并在37°C下培养2.5小时。原生质体随后被重新悬浮在Zymo DNA/RNA Shield（Zymo Research公司，美国Irvine）中。

黑曲霉ATCC 1015的原生质体被送往Plasmidosaurus公司，使用Oxford Nanopore Technology（ONT）和Illumina平台进行DNA提取和定制测序。基因组DNA使用Monarch Genomic DNA Purification Kit（新英格兰生物实验室，美国）进行纯化，过程中未进行剪切或大小筛选。Nanopore文库（v14化学体系；标签化）使用SQK-RBK114.96试剂盒（Oxford Nanopore Technologies公司，英国）制备，并在PromethION 24平台上使用两个R10.4.1流式细胞仪进行测序。碱基调用使用Guppy v6.4.6（Oxford Nanopore Technologies公司；超精确模式，Q ≥ 10）完成，接头和条形码使用MinKNOW（Oxford Nanopore Technologies公司）进行修剪，总共获得521,857条读段（243,482条读段，N50为9,597 bp；278,375条读段，N50为9,419 bp）。Illumina文库使用Illumina DNA Prep试剂盒（Illumina公司，美国）制备，并在NextSeq 2000平台上以双端读段形式进行测序（2 × 150 bp），生成2850万对读段。首先使用human参考基因组GRCh38.p135对ONT读段（使用minimap2 v2.306）和Illumina读段（使用bwa v0.7.197）进行去污染处理）。未映射的ONT读段和Illumina读段对使用samtools v1.22.18提取。最后，ONT读段使用seqkit v2.10.19去重，使用filtlong v0.3.0https://github.com/rrwick/Filtlong进行质量过滤（保留长度≥3 kb的读段），Illumina读段使用fastp v1.0.110进行接头修剪和质量/长度筛选（Q ≥ 20，长度≥50 bp）。 黑曲霉ATCC 1015的混合基因组使用Flye v2.9.6在nano-hq模式下从头组装，估计基因组大小为36 Mb（基于Nanopore读段构建支架），并使用Pilon v1.2411结合Illumina读段进行优化。组装质量使用QUAST v5.3.012和BUSCO v5.7.113以及ascomycota_odb10谱系数据集进行评估，BUSCO完整性达到99.6%。该基因组由9个contig组成（包括线粒体基因组），其中核基因组由8条染色体组成，长度为35,617,925 bp（N50为4,304,314 bp；GC含量为49.59%），以及一条31,333 bp的线粒体DNA。所有染色体级别的contig都以TTTAGGG基序终止，这是典型端粒重复序列TTAGGG的延长变体，也存在于如Chlamydomonas reinhardtii等藻类中14。Nanopore读段的测序覆盖率为59倍，Illumina读段的测序覆盖率为197倍。

线粒体contig的注释采用了参考引导的、手动策划的方法，结合了exonerate v2.4.0（针对Aspergillus flavus蛋白的protein2genome模型15）、tRNAscan-SE v2.0.1216（用于tRNA）和Infernal cmscan（Rfam）v1.1.5（用于rRNA）；特征使用AGAT v1.5.117合并。核基因组使用funannotate v1.8.1718进行注释，包括重复序列屏蔽、使用Augustus19（Aspergillus nidulans模型）进行基因预测，以及使用eggNOG-mapper v2.1.1320进行功能注释，共鉴定出11,387个蛋白质编码基因。Liftoff v1.6.321用于将特征从Aspni5组装结果2转移过来，然后使用gffcompare v0.12.1022合并注释结果。在此过程中，添加了基于蛋白质ID的别名，并在最终的GFF3文件中将假设的mRNA替换为更详细的基因名称。

致谢

我们衷心感谢奥地利联邦经济、能源和旅游部、国家研究、技术与发展基金会以及Christian Doppler研究协会对Christian Doppler可持续生物生产实验室（专注于真菌系统的定向菌株开发项目）的财政支持。本研究部分由奥地利科学基金（FWF）10.55776/COE17https://wwwCircularbioengineering.at（Circular Bioengineering卓越集群）资助。