基于SELEX技术获得的钾离子适配体在生理钠背景下的稳健检测

《Biosensors and Bioelectronics》：SELEX-derived potassium aptamers for robust detection in a physiological sodium background

　　

钾离子（K⁺）是生物学中一种至关重要的金属离子。迄今为止，基于DNA的钾离子传感器均依赖于G-四链体（G4）序列，但这些序列并非通过针对K⁺结合的筛选过程获得，而是最初为结合凝血酶、血红素或其他来源而筛选出来的。在此，研究人员报告了首次以K⁺离子为靶标，分离DNA适配体的SELEX实验。基于深度测序结果，仅富集了富含鸟嘌呤的序列。圆二色谱（CD）滴定揭示了一个名为K-R17-36的序列，其解离常数（K_d）为0.08 mM，而其截短序列K-R17-36a的K_d相似，为0.06 mM。这些亲和力比常用的K⁺结合序列，如凝血酶结合适配体（TBA）和人端粒序列（HTS），高出7倍以上。利用硫黄素T（ThT）荧光实验，研究人员发现了在K⁺结合时同时显示荧光增强和淬灭响应的序列。这种双模式响应提高了对K⁺检测的选择性。在存在150 mM Na⁺离子和人工尿液的情况下，K-R17-36适配体对K⁺的亲和力仍比HTS高出约9倍。这项工作为K⁺适配体提供了全面的理解，并提供了一种在生理条件下对K⁺具有高亲和力和稳健结合能力的适配体。

钾离子是生物学中一种至关重要的金属，参与调控包括神经传导、细胞外渗透压和血压在内的基本生理过程。血清中的正常K⁺水平范围为3.8至5.4 mM，而细胞内K⁺水平为140至150 mM。钾稳态失调与肾脏损伤、高血压、中风和肾上腺疾病有关。因此，检测K⁺对于理解生理学和疾病诊断至关重要。

传统的K⁺检测方法包括离子色谱法、原子吸收光谱法以及电感耦合等离子体质谱法或原子发射光谱法等分析仪器。这些方法虽然准确度高，但需要昂贵笨重的仪器、复杂的样品预处理和熟练的技术人员。离子选择性电极（ISE）已被广泛使用，但存在膜稳定性和选择性有限的问题。基于冠醚和其他配体的合成探针也已被开发。

DNA寡核苷酸在金属离子检测中具有吸引力。利用DNA进行K⁺检测，利用了K⁺能够稳定G-四链体（G4）结构的特性。尽管许多G4序列被称为K⁺适配体，但它们并非通过以K⁺为靶标的SELEX获得。因此，可能存在更好的K⁺结合体。最近，Lu团队通过体外选择也报道了一种钾离子特异性DNA酶。

捕获-SELEX方法允许使用游离金属离子作为靶标，已产生了一系列金属离子（从Cd²⁺、Tl⁺到稀土金属）的适配体。在这项工作中，研究人员报告了首次为K⁺离子筛选适配体的努力。利用圆二色谱（CD）光谱，研究人员鉴定出新的序列，其对K⁺的亲和力比迄今报道的最常用适配体高出7倍以上。利用硫黄素T（ThTh）荧光实验，研究人员发现了在生理条件下同时表现出K⁺诱导的荧光增强和荧光淬灭的序列，从而实现了高选择性检测。

适配体筛选是通过将一个包含30个核苷酸随机区的DNA文库，通过杂交固定在连接于琼脂糖珠的短捕获链上来进行的。筛选过程在严格不含钠离子的缓冲液（100 mM LiCl，5 mM MgCl₂，以及用LiOH调节pH至7.4的20 mM HEPES）中进行。初始12轮的K⁺浓度为20 mM，第13轮降至5 mM，第14和15轮为2 mM，最后在第16和17轮降至0.5 mM。这种逐步降低K⁺浓度的做法旨在富集高亲和力适配体。对第15轮（2 mM K⁺）和第17轮（0.5 mM K⁺）的PCR产物进行了深度测序。

第15轮文库以富含鸟嘌呤的序列为主，而第17轮文库则包含了高比例的此前被怀疑会发生靶标非依赖性释放的序列。这种转变表明0.5 mM的K⁺浓度接近有效筛选的下限，此时非特异性释放开始占据主导地位。富集的富含G的序列在第15轮文库中鸟嘌呤含量为41.4%，在第17轮文库中为41.9%。这些数值远高于完全随机DNA文库预期的25%鸟嘌呤含量。鸟嘌呤的显著富集强烈表明G4可能主导了这些适配体中的K⁺结合。这一结果与Tl⁺和Pb²⁺的选择不同。尽管这些金属离子也已知能稳定G4结构，但它们的适配体筛选既产生了G4序列也产生了非G4序列。

G4序列的分类是一个已知的挑战。在这项工作中，研究人员根据连续鸟嘌呤链的数量对序列进行分组：家族1有四个鸟嘌呤链，而家族2有五个或更多链。家族1中鸟嘌呤链之间的核苷酸通常为两个或三个核苷酸长度。第一个和第三个环区主要由胸腺嘧啶碱基组成，而第二个环区则相对富含腺嘌呤。大多数鸟嘌呤链仅包含2或3个鸟嘌呤，而一些序列有五个或更多连续的鸟嘌呤。因此，研究人员将具有长鸟嘌呤链的序列分配为家族3。使用此方法，研究人员将第17轮中的序列分配为两个家族。

为了将本工作筛选的适配体置于当前文献背景下，研究人员汇编了50篇关于钾离子适配体的论文。超过一半使用了凝血酶结合适配体（TBA），这是一个为结合凝血酶而筛选的15核苷酸序列。其次是21个核苷酸的人类端粒序列（HTS），然后是用于结合卟啉的PS2.M。当研究人员在最终的文库中搜索这三个序列时，没有找到匹配项。因此，从适配体筛选的角度来看，研究人员发现了许多新的K⁺适配体，这使我们能够系统地研究K⁺结合适配体并找到更好的适配体。

由于G4 DNA具有独特的CD特征，研究人员使用CD光谱来研究适配体结合。CD光谱允许研究人员确定适配体的真实解离常数（K_d），因为不涉及其他组分。为了公平比较，研究人员将适配体完全截短，仅保留鸟嘌呤末端的核心区域。研究人员从第15轮文库的每个家族中挑选了一个截短适配体，即K-07m、K-01m和K-15m（m表示截短），以及来自第17轮的一个截短适配体K-R17-36m。未从第17轮挑选更多序列的原因是这两个轮次中存在重复序列。此外，研究人员还测试了TBA和HTS序列作为比较基准，因为它们是K⁺检测中最常用的序列。研究人员固定每个适配体浓度为5 μM，并在不同K⁺浓度下收集其CD光谱。

K-07m适配体在260 nm处有正峰，在245 nm处有负峰，这与平行G4一致，但添加K⁺后光谱几乎没有变化。K-01m、K-R17-36m和TBA在滴定K⁺时表现出相似的变化，其中290 nm处的正峰变得更强并逐渐红移。260 nm附近的负峰也变得更强，这些变化表明形成了反平行G4。K-15m和HTS具有相似的模式，在295 nm和260-270 nm附近有两个正峰，在245 nm附近有一个负峰，表明形成了包含平行和反平行组分的混合G4。

然后，研究人员使用292 nm处的峰来量化K⁺结合，因为大多数适配体在添加K⁺后该峰有较大的变化。第15轮筛选的三个截短适配体均显示K_d高于1 mM。有趣的是，K-R17-36m的K_d为0.24 ± 0.03 mM，明显比TBA（0.9 ± 0.09 mM）更紧密，并且略优于HTS（0.4 ± 0.02 mM）。因此，研究人员发现了一种内在K_d略优于先前常用适配体的K⁺适配体。

由于K-R17-36m是一种高亲和力适配体，研究人员对其进行了进一步研究。K-R17-36m是一个具有五个鸟嘌呤链的截短适配体，因此研究人员也测试了K-R17-36（42核苷酸，带有额外的6个末端碱基对）以及一个具有四个鸟嘌呤链的进一步截短序列K-R17-36m2。42核苷酸的K-R17-36具有明显的B型DNA组分（280 nm处的正峰），并与G4特征（240 nm处的负峰）重叠。其表现出紧密的结合亲和力，K_d为0.08 ± 0.02 mM。进一步截短的K-R17-36m2在添加K⁺后经历了类似K-R17-36m的CD光谱构象变化，拟合的K_d为0.7 ± 0.01 mM。因此，42核苷酸适配体的亲和力比K-R17-36m高2.5倍，而进一步截短的K-R17-36m2的亲和力比K-R17-36m弱约3.5倍。由于捕获-SELEX方法产生的序列具有末端双链区域，保留6 bp双链对于维持高结合亲和力至关重要。总体而言，通过CD滴定，研究人员发现了一种名为K-R17-36的钾离子适配体，其结合亲和力比HTS序列强约5倍，比TBA序列强11倍，这两种序列是用于K⁺检测最流行的序列。

为了进一步了解适配体的结合特性并将其转化为荧光生物传感器，研究人员使用了硫黄素T（ThT）染料。ThT本身无荧光，但结合寡核苷酸（尤其是G4结构）后会发出荧光。添加K⁺可能影响适配体折叠，从而影响ThT荧光强度。反过来，ThT可能影响K⁺与DNA之间的相互作用。例如，如果ThT和K⁺将适配体折叠成不同的结构，则ThT衍生的K⁺表观K_d可能高于适配体的内在K_d，反之亦然。ThT荧光也可能受离子强度和G4 DNA折叠的影响。因此，ThT更常用作无标记传感方法，适配体的真实结合亲和力应依赖于CD衍生的K_d值。

基于CD数据，研究人员重点关注了K-R17-36和K-R17-36m适配体，并将其与TBA和HTS进行了比较。对于42核苷酸的K-R17-36，滴定K⁺时其ThT荧光下降了约80%，表观K_d为72 μM，这与CD滴定得到的真实K_d（80 μM）接近，表明ThT对适配体结合的影响不大。如此低的K_d值鼓励研究人员尝试等温滴定量热法（ITC）。研究人员观察到放热滴定峰，K_d为0.06 mM，与CD和ThT滴定得到的值相当。该相互作用的ΔH为-4.0 kcal/mol，ΔS为5.83 cal/K·mol。因此，焓和熵对结合均有正向贡献。钾离子脱水的需求可能是正向ΔS的原因。结合化学计量比为1.2，与其两个G-四分体之间容纳单个钾离子一致。

相比之下，K-R17-36m的荧光下降非常缓慢，未观察到明显的饱和现象，表明ThT显著抑制了其与K⁺的结合。为了解释这种抑制效应，研究人员比较了上述CD结果。K-R17-36适配体具有一个B型DNA组分（280 nm处的正峰，可归因于茎区）和一个G4特征（240 nm处的负峰）。滴定K⁺后，其构象逐渐转变为反平行G4，其特征是260 nm处有一个小的负峰和290 nm处有一个强而尖锐的正峰。相比之下，在添加K⁺之前，K-R17-36m显示出平行G4结构的特征，包括240 nm处相对较浅的负峰和260 nm处的宽正峰。随着K⁺的逐渐添加，发生了向反平行G4结构的转变，其CD光谱在约245 nm和295 nm处显示出尖锐的正峰，并在K⁺饱和时在265 nm处有一个强烈的负峰。已知ThT强烈结合平行G4结构。因此，K⁺需要克服ThT稳定的平行G4，导致亲和力弱得多。这个实验表明茎区强烈影响了该适配体的折叠。

然后研究人员尝试了TBA和HTS序列。有趣的是，它们具有相反的荧光变化趋势，HTS在K⁺结合时荧光增加约50%，而TBA减少约50%。同时，TBA和HTS的拟合K_d值分别为0.3和0.6 mM，这与CD滴定得到的值相当接近。

上述实验均在含有100 mM Li⁺的选择缓冲液中进行，研究人员获得了高亲和力适配体K-R17-36。然后研究人员在低盐条件下（移除100 mM Li⁺）使用ThT荧光测试了其选择性，K-R17-36对K⁺结合的表观K_d为97 μM。其他单价金属离子显示较低的响应。这些离子的有效离子半径为：0.76 ?（Li⁺），1.02 ?（Na⁺），1.38 ?（K⁺），1.52 ?（Rb⁺）和1.67 ?（Cs⁺）。对于NH₄⁺，报道的有效离子半径为1.48 ?。研究人员绘制了这些离子相对于K⁺的尺寸差异图，这与ThT响应非常吻合：K⁺ > Rb⁺ > NH₄⁺ > Na⁺ ? Cs⁺ > Li⁺。因此，在这种情况下，尺寸是金属结合的关键因素。K-R17-36m具有良好的选择性，尽管其对K⁺的亲和力较低，这与图4B所示的实验结果一致。有趣的是，TBA在此条件下显示出非常小的信号变化，而HTS适配体对K⁺具有最佳选择性。

上述测定要么在100 mM Li⁺中进行，要么在极低的盐浓度中进行。实际样品预期会含有高含量的NaCl。因此，研究人员也在150 mM NaCl和5 mM MgCl₂中使用ThT实验比较了适配体的响应。在这种情况下，K-R17-36适配体仍显示出K⁺依赖性结合，表观K_d为1.0 mM。该值比在100 mM Li⁺中高14倍。因此，NaCl降低了该适配体对K⁺的结合。HTS DNA仍显示出荧光增强，尽管即使添加12 mM K⁺也未达到饱和，无法拟合可靠的K_d。因此，K_d显著大于6 mM，这比在100 mM Li⁺中高19倍。因此，在这两种情况下，Na⁺都有效地与K⁺竞争结合，而K-R17-36适配体在这些样品中具有更高的亲和力。其他两个适配体的响应甚至更低，它们不能用于基于ThT在150 mM NaCl存在下检测K⁺。

为了排除ThT的影响并确定适配体在150 mM NaCl下的内在结合亲和力，研究人员使用了CD光谱。虽然Na⁺已使K-R17-36良好折叠，但添加K⁺进一步将其折叠至相同状态。量化285 nm处峰的增长仍得到一条结合曲线，拟合的K_d值为1.6 mM，这与ThT衍生的K_d值相当。相比之下，HTS的光谱显示出大得多的变化，表明该适配体在K⁺存在下的折叠状态与在Na⁺存在下的不同。其K_d为14 mM，表明其结合K⁺的能力比K-R17-36弱9倍。总之，在生理盐条件下，K-R17-36适配体对K⁺具有更好的灵敏度，而HTS具有更宽的动态范围和更大的构象变化。

K-R17-36的推测二级结构如图6A所示。由于其具有良好的结合性能，研究人员随后测试了截短。研究人员知道茎区不能完全截短，因为K-R17-36m的结合要差得多。因此，研究人员首先截短了末端茎上的前4个碱基对和一个摆动的胸腺嘧啶，并将其命名为K-R17-36a。其CD光谱在240 nm处有一个负峰，在约260 nm和290 nm处有两个正峰。添加K⁺后，它逐渐形成反平行G4，在260 nm处有一个负峰，在290 nm处有一个正峰。CD衍生的结合曲线保持了0.06 mM的优异K_d。因此，茎区虽然不能完全去除，但可以缩短。

此外，研究人员还截短了三个非配对核苷酸，以减少G4部分和双链部分之间的柔性，并将其命名为K-R17-36b。然而，K-R17-36b显示出非常差的结合，K_d达到25.1 mM。因此，柔性对于实现有效的K⁺结合至关重要。

为了评估适配体在类真实样品条件下的性能，研究人员使用了人工尿液作为样品基质。与其在含有150 mM NaCl的缓冲液中的行为一致，K-R17-36和HTS适配体在人工尿液中保留了清晰的K⁺响应信号。K-R17-36a在K⁺添加时表现出浓度依赖性的荧光下降（K_d 0.67 mM），而其他测试的阳离子，包括Li⁺、Na⁺、Rb⁺、Cs⁺和NH₄⁺，仅引起微小变化。特别是，生物学相关的Na⁺和NH₄⁺离子未显示任何响应。HTS对K⁺显示出显著的荧光增强响应，而其他阳离子在相同浓度范围内产生几乎可忽略的响应。这些结果与在150 mM NaCl缓冲液中获得的结果非常一致。总之，K-R17-36和K-R17-36a在生理条件下仍保留了对K⁺最高的亲和力，同时还具有优异的选择性。

最后，研究人员将K-R17-36a、K-R17-36和HTS组合在一起形成一个传感器阵列。为了可视化不同金属离子之间的区分，基于这三个适配体的ThT荧光响应进行了主成分分析（PCA）。在PCA得分图（图6F）中，K⁺样品沿着PC1形成了一个清晰分离的聚类，与其他离子组分良好分离。这一结果表明，由这三个适配体产生的响应特征足以区分K⁺与其他测试的离子。

在这项工作中，研究人员首次报告了针对K⁺离子的SELEX研究。通过CD滴定，研究人员发现了一个名为K-R17-36的序列，其结合亲和力高于两种最常用的K⁺结合序列（TBA和HTS）。在低盐条件下，K-R17-36显示出依赖于阳离子尺寸的结合亲和力趋势，而在150 mM NaCl中，尽管由于Na⁺的竞争导致亲和力下降，它仍保持了对K⁺的优异选择性。该适配体通过ITC表征显示其内在K_d为0.06 mM，与CD滴定值（0.08 mM）一致。其截短序列K-R17-36a显示出更好的选择性和结合亲和力。K-R17-36a和K-R17-36适配体在人工尿液中均表现出对K⁺的独特而选择性的响应，而其他竞争性阳离子仅诱导最小的信号变化。这项研究为理解K⁺结合的DNA序列提供了全面的认识，并提供了一种有趣的序列用于进一步的生物传感器应用。