《Chemico-Biological Interactions》：Bilobalide attenuates chronic restraint stress-induced neurotoxicity and cognitive impairment through glucocorticoid receptor-dependent BDNF/TrkB/PI3K/Akt signaling
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吕中婷|李翔|吴汉宁|张晓文|胡旺阳|徐勇|张杰|任莉吉林大学食品科学与工程学院，长春130062，中国摘要慢性应激是海马神经毒性和认知功能障碍的主要诱因。然而，针对这一机制的干预措施仍然有限。双叶苷是一种从银杏叶中提取的化学定义明确的倍半萜内酯，具有报道中的神经保护作用。尽管如
吕中婷|李翔|吴汉宁|张晓文|胡旺阳|徐勇|张杰|任莉
吉林大学食品科学与工程学院，长春130062，中国
摘要
慢性应激是海马神经毒性和认知功能障碍的主要诱因。然而，针对这一机制的干预措施仍然有限。双叶苷是一种从银杏叶中提取的化学定义明确的倍半萜内酯，具有报道中的神经保护作用。尽管如此，其对慢性应激引起的认知损伤的影响及其与糖皮质激素受体（GR）信号通路的关系仍不清楚。在本研究中，我们评估了双叶苷在慢性束缚应激（CRS）小鼠以及皮质酮（CORT）损伤的HT22海马神经元中的效果。双叶苷改善了CRS小鼠的短期记忆、长期记忆和空间记忆，并减轻了海马CA1、CA3和齿状回区域的神经元损伤。这些效果伴随着脂质过氧化的减少、抗氧化能力的恢复、全身炎症细胞因子释放的减弱以及海马炎症基因表达的降低，同时抑制了与凋亡相关的信号通路，并保持了树突结构、突触超微结构和突触蛋白的完整性。双叶苷还恢复了海马BDNF/TrkB/PI3K/Akt信号通路。体内和体外实验表明，双叶苷能够抑制应激增强的GR核转位，而GRE报告基因检测显示GR的激活减弱。分子对接和细胞热位移实验支持双叶苷与GR的结合。重要的是，GR敲低实验表明，双叶苷介导的氧化损伤和BDNF/TrkB/PI3K/Akt相关突触信号通路的恢复作用受到抑制。这些数据表明，双叶苷通过限制异常的GR信号通路并维持神经营养-突触稳态，从而部分保护海马免受慢性应激引起的神经毒性和记忆损伤。因此，双叶苷作为针对应激相关认知功能障碍的机制明确化合物，值得进一步研究。
引言
慢性应激是导致认知衰退的主要因素，并与海马依赖性记忆缺陷密切相关[1]。长期暴露于糖皮质激素会导致海马中的树突回缩、突触丢失、氧化损伤和炎症激活[2]，从而促进神经行为功能障碍[3]。虽然胆碱酯酶抑制剂和美金刚仍被广泛用于认知障碍的症状治疗，但其疗效有限，且不良反应常常限制了患者的长期依从性[4]。因此，寻找能够中断应激驱动的神经毒性级联反应的机制明确化合物具有重要的研究价值。
慢性应激会损害海马依赖性学习能力，降低树突复杂性，破坏突触功能，并加剧氧化和炎症损伤，从而导致记忆功能障碍[5]。由于海马富含糖皮质激素受体且对应激激素特别敏感，它成为天然化合物预防应激相关神经认知损伤的关键靶点。糖皮质激素受体（GR）信号通路是海马对应激反应的关键调节因子，尽管其效应高度依赖于具体环境[6],[7]。在生理条件下，短暂的GR激活通过促进脑源性神经营养因子（BDNF）依赖性的可塑性途径，支持适应性反应并有助于记忆巩固[6],[7]。然而，慢性或过度的糖皮质激素刺激会导致GR核持续转位和GR依赖性转录输出的失调，伴随GR负反馈调节的受损[8],[9],[10]。这些病理变化会抑制BDNF表达，破坏肌动蛋白受体激酶B（TrkB）相关的生存信号通路，并损害海马的突触重塑[8],[9],[10]。这些观察结果表明，治疗效益可能不依赖于完全抑制GR，而更依赖于在慢性应激条件下恢复平衡的GR信号通路[5],[6]。
天然来源的生物活性成分因其良好的安全性、较少的副作用和丰富的天然来源，成为早期干预认知功能障碍的有希望的候选物质[11]。双叶苷（图1A）是一种来自银杏叶的生物活性倍半萜内酯，存在于其可食用种子中，通过减轻氧化应激和神经元损伤发挥神经保护作用[12],[13],[14],[15]。先前的研究表明，双叶苷能够穿过血脑屏障，促进海马突触传递，通过激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路来抑制神经元凋亡，并在疾病相关模型中抑制炎症反应[16],[17],[18]。还有报道指出，双叶苷可以改善小鼠的空间学习能力并增加海马中的GR表达，这暗示该化合物可能与应激激素信号通路有关[19]。然而，双叶苷是否通过调节异常的GR信号通路和下游的神经营养可塑性来缓解慢性应激引起的认知损伤尚不清楚。
在本研究中，我们将慢性束缚应激（CRS）小鼠模型与皮质酮（CORT）损伤的HT22细胞模型相结合，以确定双叶苷是否能减轻慢性应激引起的海马损伤和认知功能障碍。我们评估了行为结果、组织病理学、氧化应激、炎症和凋亡指标、突触可塑性以及BDNF/TrkB/PI3K/Akt通路。我们还研究了GR核转位、GRE依赖的转录活性、基于细胞热位移测定（CETSA）的目标结合情况以及GR敲低的影响。我们的目的是确定GR是否是双叶苷在慢性应激条件下发挥神经保护作用的上游决定因素。
章节片段
动物实验
成年雄性C57BL/6J小鼠（4-6周龄），体重20 ± 2克，购自辽宁长盛生物技术有限公司（SCXK (Liao) 2020-0001）。这些小鼠在吉林大学实验动物中心的屏障设施中饲养，环境温度为25 ± 1°C，湿度为60%。吉林大学动物伦理委员会批准了所有小鼠的使用和护理。动物研究方案已获得吉林大学动物实验伦理委员会的批准。
双叶苷改善了小鼠的CRS诱导的学习和记忆缺陷
图1C展示了Y迷宫的示意图及不同组小鼠的代表性轨迹图。CRS小鼠在新路径上的停留时间明显短于对照组；双叶苷处理的小鼠表现出探索行为的恢复（图1D），表明CRS损害了小鼠的短期记忆，而双叶苷有效缓解了这种损伤。为了排除运动活动改变或探索动机对Y迷宫表现的影响，我们进行了进一步分析
讨论
本研究显示，双叶苷显著减轻了CRS引起的认知障碍和海马损伤。双叶苷改善了Y迷宫、NOR和MWM测试中的短期和长期记忆表现；减轻了CA1、CA3和DG区域的神经元损伤；降低了氧化应激、全身炎症介质和与凋亡相关的信号通路；保持了树突结构、棘突密度和突触超微结构；并恢复了海马BDNF/TrkB/PI3K/Akt相关的可塑性
结论
总之，双叶苷对慢性应激引起的海马功能障碍和认知损伤具有显著的神经保护作用。这种神经保护作用与突触完整性的维持和BDNF/TrkB/PI3K/Akt信号通路的恢复有关。从机制上看，双叶苷抑制了应激增强的GR核转位，并有助于在慢性应激条件下恢复正常化的GR信号通路。GR信号通路的紊乱显著减弱了这种损伤
CRediT作者贡献声明
徐勇：研究、数据管理。任莉：写作——审稿与编辑、概念构思。张杰：写作——审稿与编辑、概念构思。吕中婷：写作——初稿撰写、研究。吴汉宁：研究、数据管理。李翔：研究、数据管理。胡旺阳：研究、数据管理。张晓文：研究、数据管理
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的研究工作。
致谢
本研究得到了吉林省科学技术发展项目基金（项目编号：20240602079RC）的支持。
