《ACS Chemical Neuroscience》：Caffeic Acid Ameliorates l-Methionine-Induced Hyperhomocysteinemia, Leading to Decreased Adult Neurogenesis and Oxidative Stress Status in Adult Rats
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慢性L-甲硫氨酸（l-Met）处理可诱导高同型半胱氨酸血症，通过增加氧化应激损害神经发生和记忆功能。咖啡酸（CA）具有抗氧化特性，可减少脑部氧化损伤并促进神经发生。本研究旨在探讨咖啡酸对L-甲硫氨酸影响海马神经发生的神经保护作用。四十只雄性Sprague-Da
慢性L-甲硫氨酸（l-Met）处理可诱导高同型半胱氨酸血症，通过增加氧化应激损害神经发生和记忆功能。咖啡酸（CA）具有抗氧化特性，可减少脑部氧化损伤并促进神经发生。本研究旨在探讨咖啡酸对L-甲硫氨酸影响海马神经发生的神经保护作用。四十只雄性Sprague-Dawley大鼠被随机分为四组（每组n=10）：对照组、l-Met组、CA组以及CA+l-Met组。大鼠每日接受l-Met（1.7 g/kg）和/或CA（40 mg/kg）的口服灌胃处理，持续28天。结果显示，通过免疫荧光染色证实，CA改善了l-Met诱导的齿状回（DG）颗粒下区（SGZ）中双皮质素（DCX）和性别决定区Y框蛋白2（Sox-2）阳性细胞的减少。蛋白质印迹分析表明，CA逆转了l-Met诱导的海马蛋白核因子E2相关因子2（Nrf2）、Sox-2和脑源性神经营养因子（BDNF）表达的下降。此外，CA缓解了l-Met诱导的氧化损伤，并降低了前额叶皮层（PF）和海马中的抗氧化酶活性。这些发现证明了咖啡酸能够对抗L-甲硫氨酸诱导的神经毒性。
目前，全球痴呆症的患病率正在上升，影响数百万人。痴呆症正变得越来越普遍，成为一个重大的公共卫生问题，影响着学习、记忆和认知功能。多项研究已证实，自由基的产生会导致氧化应激，对脂质、蛋白质和核酸造成损害。这种损害加速了与痴呆症相关的神经退行性疾病的发展。L-甲硫氨酸（L-Met）是一种必需的、非极性氨基酸，常见于肉类、鱼类、鸡蛋、芝麻油和谷物等食物中。L-Met是几种重要生物分子（如半胱氨酸和牛磺酸）的底物。通过甲基化途径，它可转化为同型半胱氨酸（Hcy）。Hcy水平过高与氧化剂的产生有关，这些氧化剂通过高度活性的自由基对神经元造成损害，进而破坏神经元细胞的氧化还原系统，诱发并加速脂质过氧化事件。慢性L-甲硫氨酸处理（动物体重1.7 g/kg）会升高Hcy水平，诱导高同型半胱氨酸血症（HHcy），可能导致中风和血管性痴呆等脑血管疾病。此外，以1.7 g/kg的剂量给予L-Met持续28天，可导致细胞增殖和存活减少，同时细胞周期阻滞增加，从而引起空间和识别记忆缺陷。
神经发生是指在整个生命周期中持续在海马齿状回产生新的神经元的过程；然而，随着年龄增长，神经发生会下降，并受到影响神经发生过程的负面因素的干扰。相反，暴露于丰富环境以及植物来源的化合物（包括橙皮苷、积雪草酸、白杨素和CA）可以增强海马神经发生和神经保护特性。
咖啡酸（CA）是一种羟基肉桂酸，是一种天然的酚类化合物，存在于番茄、浆果、茶叶、咖啡和葡萄酒等植物和食物中。CA具有抗氧化特性，能有效清除活性氧（ROS），从而中和脂质过氧化标志物。先前一项研究探讨了CA在20和40 mg/kg剂量下对氧化应激和抗氧化酶活性的影响。CA在40 mg/kg的剂量下，能够改善与细胞增殖和存活相关的记忆缺陷，减少细胞周期阻滞，并有效增强抗氧化酶活性，减少神经元凋亡和氧化应激，这在L-Met和衰老模型中均得到证实。本研究旨在探索CA在40 mg/kg剂量下如何影响氧化状态、抗氧化酶活性以及与神经发生和神经干细胞相关的特定蛋白标志物的表达。这项研究可能最终揭示CA减轻高同型半胱氨酸血症有害影响的新途径。
在实验中，研究人员购买了4-5周龄、体重200-220克的雄性Sprague-Dawley大鼠，并用于所有实验程序。大鼠被饲养在不锈钢笼中，并在28-30°C下维持12小时光照/暗周期。大鼠可无限获取食物和水。实验方法获得了孔敬大学动物研究伦理委员会的批准。在给药前，大鼠被随机饲养7天以适应环境。CA和l-Met的供应商为Sigma-Aldrich Chemical Co.。大鼠被随机分为四组：溶剂组；L-Met组（l-Met 1.7 g/kg/天，溶解于0.1% w/v羧甲基纤维素[CMC]中）；CA组（CA 40 mg/kg/天，剂量来源于先前研究，溶解于丙二醇中）；以及CA联合L-Met组（CA+l-Met）。CA和L-Met均通过口服灌胃给药。溶剂组动物通过口服灌胃给予溶剂（丙二醇和0.1% w/v CMC）。所有处理（包括L-Met、CA和溶剂）在同一天开始，并持续4周。
为了评估海马神经发生，研究人员使用了免疫荧光染色技术。具体来说，通过双皮质素（DCX）染色来评估不成熟神经元，DCX是成体神经发生过程中广泛使用的不成熟神经元标志物。同时，采用性别决定区Y框蛋白2（Sox-2）免疫荧光染色法来研究细胞发育、自我更新和多能性，Sox-2是神经干细胞自我更新和多能性的重要标志物。组织制备包括用4%多聚甲醛固定大鼠大脑，并使用冷冻切片机在冠状面上进行连续切片。
在生物化学评估方面，研究人员测量了海马和前额叶皮层组织中的丙二醛（MDA）水平，MDA是脂质过氧化的终产物。此外，还测定了过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，以评估抗氧化酶系统的功能。
蛋白质表达分析通过蛋白质印迹法进行，旨在量化海马组织中核因子E2相关因子2（Nrf2）、Sox-2和脑源性神经营养因子（BDNF）的蛋白水平。血清同型半胱氨酸水平通过酶法分析仪进行测定。
数据统计使用GraphPad Prism软件进行，计量资料以均数±标准误表示。采用单因素方差分析（ANOVA）进行组间比较，事后检验采用邓尼特检验或邦弗伦尼检验。
研究结果显示，与溶剂组相比，单独接受L-Met处理的大鼠血清同型半胱氨酸水平显著升高。然而，CA与L-Met联合处理组的同型半胱氨酸水平显著低于单独L-Met处理组。
在海马神经干细胞方面，与溶剂组相比，L-Met处理组Sox-2阳性细胞数量显著减少。而CA组和CA+l-Met组的Sox-2阳性细胞数量均显著高于溶剂组，表明CA可以增强并防止L-Met引起的神经干细胞减少。
在不成熟神经元方面，L-Met处理导致DCX阳性细胞数量较溶剂组显著减少。相反，CA处理组的DCX阳性细胞数量较溶剂组显著增加，且CA+l-Met组的DCX阳性细胞数量显著高于L-Met组。
在抗氧化酶活性和脂质过氧化方面，L-Met处理导致海马和前额叶皮层中的MDA水平显著升高，而CAT、SOD和GPx活性显著降低。CA处理以及CA与L-Met联合处理均能显著降低MDA水平，并提高CAT、SOD和GPx的活性。
蛋白质印迹分析显示，L-Met处理显著降低了海马中Nrf2、Sox-2和BDNF的蛋白表达。而CA处理以及CA与L-Met联合处理均能显著增加这三种蛋白的表达水平，且联合处理组的表达水平显著高于单独L-Met处理组。
讨论部分指出，本研究的主要发现是L-Met处理的大鼠表现出海马神经发生减少，其证据是海马齿状回中Sox-2和DCX阳性细胞表达的减少。慢性给予L-Met导致血清Hcy水平显著升高，这证实了过量L-Met会导致高同型半胱氨酸血症，进而诱发神经炎症并损害神经发生。L-Met诱导神经发生受损的主要机制可能与海马中氧化应激增加有关。CA具有强大的抗氧化特性，可能通过中和MDA水平、提高抗氧化酶活性以及清除由Hcy积累引起的自由基，从而降低血清Hcy水平。
L-Met增加了海马区的MDA水平并降低了Nrf2、Sox-2和BDNF的表达，同时降低了CAT、GPx和SOD等抗氧化酶的活性。而CA通过降低MDA水平、增加DCX和Sox-2阳性细胞的表达来改善抗氧化活性，并改善了L-Met诱导的Nrf2、Sox-2和BDNF表达的下降。
研究还探讨了Nrf2/ARE信号通路的作用，该通路作为抗氧化防御机制至关重要。CA可能通过该通路发挥作用。此外，BDNF作为对神经发生和神经元存活至关重要的神经营养因子，其表达的增加可能与CA的神经保护作用有关。Nrf2和Sox-2通路之间的相互作用对于维持细胞多能性、干性和存活至关重要。
研究结论表明，咖啡酸（CA）通过增加神经干细胞和一种不成熟神经元标志物，减少MDA的过度产生，并在海马和前额叶皮层中提高GPx、CAT和SOD的活性，从而在成年大鼠中展现出对高同型半胱氨酸血症的神经保护作用。这些发现可能为未来的认知障碍疗法提供新思路。
